بخشی از مقاله
چکیده
نقطه شروع بسیاری از روشهای بیولوژی مولکولی ضرورت جداسازی DNAبا کیفیت عالی است . معمولاً کیفیت DNA با عواملی از قبیل عدم آلودگی ناشی از RNA ، لیپید و سایر ساختارهایی که برای آنزیمهای برشی و پلی مرازها مزاحمت ایجاد می کنند سنجیده می شود. در بعضی تحقیقات به دلایل مختلفی نمونه های گیاهی مورد مطالعه که از طبیعت جمع آوری میشود این نمونه ها به علت وجود کربوهیدراتها، ترکیبات پلی فنلی و پروتئینها با مشکلاتی روبرو است به ویژه آنکه این ترکیبات به شکل کمپلکس با اسیدهای نوکلئیک ترکیب میشوند و جداسازی آنها را با مشکل مواجه میکند بنابراین روش های استخراج که این مواد را بتواند به حداقل برساند بسیار مطلوب هستند در این تحقیقDNA ژنومی از برگ گیاهان خانواده شمعدانی Geranium L. که دارای دوگونه دارویی G. purpureum VILL. و G. robertianum L. در ایران می باشد با سه روش Porebski et al , Murry and Thompson, Saghai- Mahroofاستخراج گردید. نتایج به دست آمده نشان داد که روش Saghai-Mahroof با اندکی تغییرات از بقیه روشها بهتر بود. از این رو روش Saghai-Mahroof توانست متابولیتهای ثانویه عمده این دو گونه دارویی را جداسازی کرده و میتوان پیشنهاد نمود که این روش جهت استخراج DNA از گیاهانی که دارای متابولیت های ثانویه و پلی ساکاریدها بدون استفاده از نیتروژن مایع وفنول می باشد استفاده کرد.
کلمات کلیدی: استخراج DNA، متابولیت های ثانویه، نبود نیتروژن مایع وفنول.
.1 مقدمه
نقطه شروع بسیاری از روشهای بیولوژی مولکولی ضرورت جداسازی DNA با کیفیت عالی است.معمولاً کیفیت DNA با عواملی از قبیل عدم آلودگی ناشی از RNA ، لیپید و سایر ساختارهایی که برای آنزیمهای برشی و پلی مرازها مزاحمت ایجاد می کنند سنجیده می شود . به علت بزرگ بوده اندازه مولکول DNA ، روشهای استخراجی باید حداقل استرس مکانیکی را در طی مراحل استخراج ایجاد نماید . معمولاً روشهایی که در آنها چندین شوینده همچون SDS و TRITON X100 استفاده میشود که نقش آنها لیز نمودن سلول و کمک به از بین بردن پروتئین متصل به DNA می باشد . پروتئین زدایی بیشتر از طریق پروتئناز K صورت می گیرد که این ماده در بافر لیز کننده مورد استفاده قرار می گیرد . این آنزیم در حضور SDS در دمای 56-65 درجه سانتیگراد فعالیت دارد. تحت این شرایط پروتئین بهتر واسرشت می شود . برعکس در همین شرایط آنزیمهای دیگری مثل DNAase دناتوره می شود .
متعاقب استفاده از پروتئیناز K ایزوپروپانول برای از بین بردن مؤثر پروتئین ها استفاده می شود . و باقیمانده پروتئین و لیپید نیز به طور مؤثر از طریق کاربرد فنل و کلروفرم از بین می رود . آلودگی RNA از طریق تیمار کردن نمونه با RNAase از بین می رود . در روشهای دیگر بعد از پروتئیناز از نمک اشباع برای رفع آلودگی پروتئین استفاده می شود. در استخراج DNA بهتر است از هپارین استفاده نشود چون هپارین فعالیت Taq پلی مراز جلوگیری می کند. وجود EDTA به میزان حداقل Mm 2 در بافر استخراج باعث می شود که کوانزیمهای DNAase با EDTA شلات می شود و از تجزیه تصادفیDNA جلوگیرینماید. . شیوه هایی که جهت خالص سازی DNA مورد استفاده قرار می گیرد علاوه بر برخورداری از حداقل زمان و سرعت بالا ، روش مطمئنی جهت حذف ممانعت کننده ها - - inhibiators و خالص نمودن کلیه اسید های نوکلئیک نیز باشد . این ممانعت کننده ها گوناگون بوده و می توانند در ارتباط به نوع نمونه متفاوت باشند . در صورتیکه خالص نمودن DNA در نمونه از کیفیت پایینی برخوردار باشد ، بواسطه اثر مهار کنندگی مواد موجود در نمونه ها و یا مواد استفاده شده در مراحل خالص سازی ، بر فعالیت پلیمراز اثر گذاشته و نتیجه تست منفی کاذب خواهد گردید. استخراج DNA مطلوب از گیاه برای بررسی های ژنتیکی از اهمیت ویژه ای برخورداراست.
به طور کلی برای انجام یک واکنش PCR خوب نیاز به استخراج یا تخلیص DNA داریم ; در واقع PCR واکنش زنجیره ای پلیمراز است که برای تکثیر یک ناحیه ی ژنتیکی مشخص در یک عامل بیولوژیک خاص که توسط پرایمر اختصاصی شناسایی می شود به کار میرود. در تمامی روش های مبتنی بر PCR برای اهداف مختلف، استخراج DNA گام اول و مهم می باشد. هر چه قدر روش استخراج DNA سریع، مقرون به صرفه وDNA حاصل دارای کیفیت بیشتری باشد، برای انجام PCR مناسب تر است. در این مطالعه از سه روش مختلف استخراج - Murry and Thompson - 1 - , Saghai- Mahroof - 2 - , Porebski et al. - 3 که از پیش برای گیاهان چوبی یا علفی گزارش شده بودند بر روی برگ های جوان و نمونه های خشک شده هرباریومی استفاده گردید. نتایج به دست آمده نشان داد که روش Saghai-Mahroof با اندکی تغییرات از بقیه روشها بهتر بود، از همه مهمتر اینکه در این روش مواد سمی و خطرناک همچون فنول ، نیتروژن مایع و همچنین پروتینازK ، Rnase استفاده نمیشود که میتواند از لحاظ مالی هم مقرون به صرفه باشد.
.2 مواد و روش ها:
- -2-1 مراحل استخراج DNA 0/03 -1 گرم از برگ های جوان گیاه - خشک شده - را در هاون چینی بدوننیتروژن مایع به شدت سائیده تا کاملاً به صورت پودر درآیند. سپس پودر حاصله به یک ویال 2 میلی لیتری منتقل گردید شکل - - 1 500 -2 میکرولیتر از بافر استخراج 2% Triton-X EDTA, 120mM Tris-HCl, 1M NaCl, 0.5M sucrose, 50mM - 100, and 0.2% β-mercaptoethanolرا - که قبلاً در 60 درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت حرارت داده شده به ویال های استخراج اضافه نموده و بوسیله ورتکس کاملاً مخلوط شدند - به ازای هر 10 سی سی محلول PVP 0/1 اضافه شود - .
-3 ویال ها به مدت 10 دقیقه روی شیکر قرار گرفتند.
-4 در زیر هود به نمونه ها 60 میکرولیتر محلول 2-Mercaptoethanol اضافه کرده و برای یکنواخت کردن مخلوط، نمونه ها ورتکس شدند.
-5 ویال ها به صورت افقی - برای جلوگیری از رسوب مواد - به مدت 40 دقیقه درون انکوباتور 60 درجه سانتیگراد قرار گرفتند و هر 10 دقیقه ویال ها به آرامی چرخانده و واژگون شدند. نمونه ها در سانتریفیوژ به مدت 15 دقیقه در 10000 دور قرار گرفت.
-6 به هر کدام از آن ها1500 میکرو لیتر بافر استخراج دو - 20mM EDTA, 100mM Tris-HCl, 1.5M NaCl, 2% CTAB, 1% β-mercaptoethanol - اضافه نموده
-7 ویال ها به صورت افقی - برای جلوگیری از رسوب مواد - به مدت 30 دقیقه درون انکوباتور 60 درجه سانتیگراد قرار گرفتند و هر 10 دقیقه ویال ها به آرامی چرخانده و واژگون شدند. نمونه ها در سانتریفیوژ به مدت 15 دقیقه در 12000 دور قرار گرفت. حال دو فاز تشکیل می شود که فاز رویی را نگه داشته و زیری را دور می ریزیم.
-8 دو برابر حجم هر ویال مخلوط کلروفوم: ایزوآمیل الکل اضافه نموده و دو فاز تشکیل شده را به آرامی به مدت 10 دقیقه روی شیکر قرار گرفتند، سپس در 12000 rpm به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق سانتریفوژ شدند.
-9 فاز بالایی که حاوی DNA می باشد را به یک ویال جدید منتقل گردید . در این مرحله باید دقت شود تا از فاز میانی و پایینی که به ترتیب حاوی پروتئین و چربی می باشند به ویال جدید منتقل نگردد.
-10 به منظور خلوص بیشتر DNA استخراجی، مراحل 8 و 9 یک مرتبه دیگر تکرار گردید.
- 11 دو برابر حجم هر ویال به آن ایزوپروپانول سرد اضافه و به مدت 60 دقیقه تا 24 ساعت درون فریزر -20 درجه سانتیگراد قرار داده شدند.
