بخشی از مقاله
مقدمه
داروهاي شیمیایی با وجود کارآیی که دارند اما داراي اثرات نامطلوب فراوانی هم هستند، این موضوع باعث شده محققین به مواد طبیعی (که داراي اثرات نامطلوب کمتري هستند) بیشتر توجه نمایند. امروزه در اکثر کشورها از گیاهان دارویی در فرآیندهاي درمانی استفادههاي مختلفی میشود .(12)
آویشن یکی از گیاهان دارویی مهم در ایران است که در طب سنتی و مدرن کاربرد فراوان دارد .(20) جنس آویشن
(Thymus)، یکی از جنسهاي خانواده نعناعیان
(Lamiaceae) است که در زیرخانواده Nepetoideae قرار دارد .(19) با توجه به اهمیت این گیاه در صنایع دارویی، محققان به دنبال آن میباشند که با استفاده از فنآوریهاي زیستی علاوه بر مطالعات پایه (از قبیل شناسایی گونهها و تاکسونومی)، به کاربردهاي زیستی تولید داروها و مهندسی متابولیک آن بپردازند.
همانند بسیاري از فنآوریهاي دیگر، زیستفناوري داراي مزایاي زیادي میباشد و با توجه به نیاز فراوان به این رشته، هر روز شاهد ظهور فنون جدید آزمایشگاهی یا
66
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
بهبود فنون قبلی در مطالعات و پژوهشهاي این رشته می توان بود. یکی از مهم ترین تکنیکهاي پایه در علوم
DNA نوترکیب و مهندسی ژنتیکی و سایر مطالعات ژنتیکی، استخراج DNA است و شاید بتوان گفت استخراج اسیدهاي نوکلئیک اولین گام در انجام اینگونه مطالعات است .(1) از آنجایی که در اکثر فنون آزمایشگاهی از تکنیک واکنش زنجیرهاي پلیمراز (PCR) براي آنالیز DNA
استخراج شده استفاده میشود و با توجه به حساسیت زیاد این سیستم به یک الگو با کیفیت و کمیت مناسب (7) نیاز به بهینهسازي روش استخراج احساس میشود. وجود ترکیبات بازدارنده در محلول DNA استخراج شده باعث جلوگیري از فعالیت آنزیمهاي تک پلیمراز در واکنش زنجیرهاي پلیمراز (PCR) و همچنین مانع عمل آنزیمهاي برشگر میشود .(9) روشهایی که نیاز به تجهیزات پیشرفته آزمایشگاهی نداشته باشد و با هزینه کمتري بتوان DNA
قابل استفاده از لحاظ کمی و کیفی بهدست آورد، بسیار مورد اهمیت است. با وجود اینکه ایده اصلی پشت استخراج DNA خیلی پیچیده نیست، دستورالعملهاي مختلف استخراج DNA براي گونههاي خاصی پیشنهاد شده است و دستورالعملهاي منتشر شده لزوماً قابل استفاده براي همه گونهها نیست .(21) مشکلی که عمدتاً در طی استخراج رخ میدهد این است که ترکیباتی از قبیل پلی-
ساکاریدها و ترکیبات فنلی به شکل کمپلکس با اسیدهاي نوکلئیک باند میشوند (23)، که تغییر در pH و ترکیب بافر استخراج توانسته است در بهبود کمیت و کیفیت
DNA استخراج شده تا حدودي موثر باشد .(18)
تحقیقات متعددي جهت بهینهسازي روش استخراج صورت گرفته است بهطور مثال شلفرد و همکارانش
(2002) دستورالعملهاي استخراج را در سه گونه مختلف با بافتهاي تازه و فریز شده مقایسه نمودند و دریافتند که بافتهاي فریز شده داراي غلظت DNA بیشتري هستند
.(22) امام جمعه و همکاران (2006)، چهار روش استخراج DNA ژنومی را در Agaricus bisporus با هم
مقایسه کردند، این محققین هر چهار روش را مناسب دانستند و پیشنهاد دادند که هر پژوهشگر براساس امکانات آزمایشگاهی دردسترس، یکی از روشها را انتخاب نماید
.(14) در تحقیقی دیگر جهت بهینهسازي استخراج DNA
از گیاهان دارویی که در مناطق مختلف ترکیه رشد میکنند چهار روش مورد آزمون قرار گرفت و نتیجه گرفته شد هنگامی که از گیاهان بالغ استفاده می شود هیچکدام از روشها نتیجه مطلوبی را بهدست نمیدهد و این به علت وجود متابولیتهاي ثانویه در این نوع گیاهان میباشد
.(25)
در اکثر منابعی که مورد بررسی قرار گرفت مشخص شد که استخراج از بافتهاي جوان به مراتب نتایج بهتري را نسبت به وقتی که بافت پیر بوده ارائه میدهد 10)، 17 و (26؛ اما در مواقعی محقق براساس نوع تحقیق و یا به اجبار باید از سطح طبیعت و یا مزرعه نمونهبرداري کند که در این حالت اکثر گیاهان به گل رفته و متابولیتهاي ثانویه زیادي در گیاه تولید شدهاند. این موضوع سبب میشود کیفیت مطلوبی در حین استخراج DNA مشاهده نشود.
بنابراین در این تحقیق به بررسی و بهینهسازي روشی مناسب و مطلوب براي گیاه بالغ آویشن پرداخته شد تا بتوان به یک روش مناسب جهت استخراج DNA آن دست یافت و آن را به دیگر گیاهان بالغ هم تعمیم داد. در این مطالعه از چهار روش مختلف استخراج استفاده گردید.
همچنین رسوبهاي بهدست آمده در روشهاي مختلف جهت درك بهتر از ماهیت مواد موجود در آنها مورد آنالیز فیتوشیمیایی قرار گرفت.
مواد و روشها
مواد گیاهی: نمونههاي مورد بررسی از مزرعه تحقیقاتی مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور جمعآوري شد.
نمونهها همه از گیاهان بالغ و به گل رفته انتخاب گردید.
برگهاي گیاهان پس از شستشو با آب مقطر توسط ازت مایع پودر و به آزمایشگاه تحقیقاتی دانشکده کشاورزي
67
بررسی کمیت و کفیت DNA
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
دانشگاه لرستان منتقل و درون میکروتیوپ در دماي -80
درجه سانتیگراد تا زمان استخراج نگهداري شد.
استخراج :DNA در این تحقیق، روشهاي مختلف استخراج شامل، دویل و دویل (13)، دلاپورتا (11)، کانگ و یانگ
(15) و خانوجا (17) با توجه به کمیت و کیفیت DNA
مورد مقایسه قرار گرفتند. در ادامه یک روش دیگر که مشابه روش خانوجا ولی با کمی تغییرات بود هم مورد آزمون قرار گرفت. در روش خانوجاي تغییریافته، تعداد دورهاي سانتریفیوژ متفاوت از دستورالعمل اصلی انتخاب گردید (مرحله اول 8000 دور، مرحله دوم 10000 دور)؛
همچنین اولین رسوب DNA بهدست آمده، با الکل 80
درصد همراه با سانتریفیوژ در 1000 دور در دقیقه به مدت
3 دقیقه در دماي 4 درجه سانتیگراد شستشو داده شد و بعد از خشک کردن رسوب به جاي بافر TE با نمک بالا، در آب مقطر دو بار استریل حل گردید. از آنجا که انجام مراحل بعدي پروتکل موجب تشکیل رسوب ژلاتینی
DNA شد بهگونهاي که پس از غلظتسنجی نمونهها، مقدار DNA بهدست آمده کمتر و از کیفیت مطلوبی برخوردار نبود استخراج در این مرحله به پایان رسانده شد که این کار موجب کوتاه تر شدن مدت زمان استخراج گردید. با توجه به نقش NaCl در استخراج DNA خالص
3) و (26، در این روش علاوه بر بافر استخراج که شامل NaCl غلیظ 5) مولار) بود، در مرحله افزودن ایزوپروپانول هم مجدداً از NaCl غلیظ 5) مولار) استفاده گردید.
استخراج شده: با استفاده از
الکتروفورز DNA بر روي ژل آگارز 0/8 درصد و مقایسه تراکم نوارهاي DNA هر نمونه با تراکم نوارهاي نشانگر کیفیت باند DNA هر نمونه مشخص شد. براي هر نمونه 8
میکرولیتر DNA استخراج شده با 2 میکرولیتر بافر بارگذاري مخلوط شد و در چاهکهاي ژل آگارز در شرایط بافري TAE تخلیه گردید و با اعمال ولتاژ ثابت 90 ولت به مدت 60 دقیقه الکتروفورز گردید
به منظور بررسی کمیت DNA استخراج شده از دستگاه بیوفتومتر استفاده گردید. در ابتدا جهت بالا بردن دقت دستگاه غلظت DNA نمونهها کاهش داده شد. بدین منظور غلظت نمونهها با نسبت 5 به 195 آب مقطر استریل تنظیم گردید و بعد از بلانک دستگاه با آب مقطر استریل، نسبت جذب 260 به 280 و غلظت DNA بر اساس نانوگرم در میکرولیتر قرائت گردید.
آنالیز فیتوشیمیایی: در روش خانوجاي تغییریافته گیاهانی که بافت پودر شده آنها خشبیتر بودند، بلافاصله بعد از افزودن نمک در مرحله انکوبه کردن با ایزوپروپانول، در ویال حاوي محلول DNA، رسوب چسبناك قهوهاي رنگی تشکیل میشد که در سایر روشها مشاهده نگردید. بنابراین، این رسوب مورد بررسی قرار گرفت، تا ترکیبات موجود در آن شناسایی شوند.
به دلیل اینکه رسوبهاي قهوهاي رنگ به دست آمده از لحاظ رنگ و نمونه مورد بررسی با هم متفاوت بودند، هر رسوب بهطور جداگانه نگهداري گردید. در ابتدا 10
رسوب مختلف از لحاظ رنگ به طور تصادفی انتخاب گردید. تست حلالیت براي آنها به وسیله 10 حلال مختلف
(متانول، اتانول، دي متیل فرم آمید، پروپانول، اتر، کلروفرم، اتیل استات، تترا هیدرو فوران، تولوئن و آب مقطر) انجام شد. با وجود اینکه تمام این حلالها تا حدودي توانستند رسوب را در خود حل کنند اما جهت بررسیهاي بعدي از حلال آب مقطر استفاده شد که کار با آن سادهتر بود.
بنابراین نمونهها با آب مقطر به حجم 25 میلیلیتر رسانده و طیف UV آنها با استفاده از دستگاه UV- (SHIMADZU) Visible گرفته شد. سپس براي تعیین کیفی و گروههاي عاملی موجود در این رسوبها، طیف IR آنها با استفاده از دستگاه IR (SHIMADZU) به دست آمد. براي این منظور ابتدا 0/01 میلیگرم از رسوب همراه با 0/02 میلیگرم از ماده KBR در هاون به خوبی با هم مخلوط گردید، سپس توسط دستگاه پرس به صورت قرص درآورده و از قرص
68
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
حاصل طیف گرفته شد. در انتها براي تعیین نوع مواد و میزان مواد موجود در رسوب از نمونهها طیف GC-Mass
گرفته شد. براي این کار ابتدا 0/001 میلیگرم از رسوب را در متانول حل کرده و به میزان 2 میکرولیتر از محلول توسط سرنگهاي خاص به دستگاه تزریق گردید و طیف آن به دست آمد.
نتایج و بحث
از بین روشهاي مورد آزمون روش خانوجا با اندکی تغییرات نتایج بهتري را نشان داد. کیفیت DNA استخراج شده در این روش از روشهاي دیگر بالاتر بود (شکل .(1
این روش بهینه شده به نوعی ترکیبی چند روش متداول میباشد. استفاده از روشهاي ترکیبی میتواند نتایج بهتري را نسبت به روشهاي متداول داشته باشد .(5)
