بخشی از مقاله
مهندسي متابوليک در لاکتيک اسيد باکتري ها
چکيده
مهندسي متابوليک عمل بهينه سازي ژنتيکي در سلول ها است که به منظور افزايش توليد سلولي يک ماده خاص انجام ميشود. مهندسي متابوليک به طور معمول در جهت کاهش انرژي سلولي و کاهش توليد ضايعات عمل ميکنـد. روش هاي معمولي مهندسي متابوليک نيازمند دانستن جزئيات کينتيک آنزيم ها، شبکه ي سيستم و مسيرهاي حد واسط ديگر ميباشد.ب رخلاف آن در مهندسي متابوليک معکوس در ابتدا فنوتيپ مورد نظر شناسايي ميشود، سپس شرايط محيطي يا ژنتيکي که اين محيط را ميدهدمشخص ميشود و در آخر فنوتيپ سلول ميزبان را با دستکاري ژنتيکي تغيير ميدهنـد.
استارترهاي مهندسي متابوليک که در درگير غيـر فعـال سـازي ژن هـاي نـامطلوب يـا overexpression ژن هـاي نامطلوب يا جديد است استفاده ميشوند تا مسيرهاي متابوليکي را به وسيله ي تغيير در متابوليسم انرژي يا غلظت مـواد حد واسط متابوليکي يا محصولات نهايي کاملا جديد به جهتي ديگر هدايت کند. در اين تحقيق مروري بر روش هـاي مهندسي متابوليک در اسيدلاکتيک باکتريها خواهيم داشت .
کليد واژه : ژن ،لاکتيک اسيد باکتريها،متابوليسم و اکسيداسيون
١- مقدمه
مهندسي متابوليک عمل بهينه سازي ژنتيکي در سلول ها به منظور افزايش توليد سلولي يک ماده خاص است . مهندسي متابوليک به طور معمول در جهت کاهش انرژي سلولي و کاهش توليد ضايعات عمل ميکند.
طبق تعريفي ديگر مهندسي متابوليک برميگردد به تغيير هدف دار مسيرهاي متابوليکي که در يک ارگانيسم يافت ميشودبه منظور درک بهتر و استفاده از مسيرهاي سلولي براي انتقال انرژي وتغييرات شيميايي ميباشد.
در اين مسير به اصولي از مهندسي شيمي،علوم محاسباتي ،بيوشيمي و زيست شناسي ملکولي نياز است .در اصل مهندسي متابوليک انجام اصول مهندسي طراحي و تجزيه و تحليل مسيرهاي متابوليکي است .به منظور رسيدن به يک هدف خاص .اين هدف ممکن است افزايش توليد محصول باشدمثل توليد آنتي بيوتيک يا پلي مرهاي بيوسنتيکي .و يا توسعه توانايي هاي متابوليکي بوسيله ي اضافه کردن يک فعاليت از محيط خارج براي توليدات يا تجزيه شيميايي .
مهندسي متابوليک براي بهتر کردن روش هاي توليد سويه هايي که ميتوانند متابوليت هاي مفيد را بيشتر توليد کنند ميتواند استفاده شود. کوشش هاي اخير بر روي جايگزيني فرايندهاي بيولوژيکي به جاي پروسه هاي شيميايي متمرکز شده اند.
٢- انتخاب روش تغيير ژنتيکي
در مورد تکنيک هاي DNA،روش هاي مختلفي استفاده مي شود براي تغيير سلول ميزبان براي رسيدن به هدف مورد نظر که شامل حذف يک آنزيم يا جلوگيري از اثر آن تا يک مسير رقابتي يا يک محصول جانبي سمي حذف شود.توسعه ي يک ژن يا گروهي از ژن ها براي بهتر کردن سنتز محصولات موجد براي توليد محصولات جديد و ايجاد مسيرهايي براي تجزيه ي محصولات سمي .
٣- مهندسي متابوليک معکوس
روش هاي معمولي مهندسي متابوليک نيازمند دانستن جزئيات کنتيک آنزيم ها ،شبکه ي سيستم ،مسيرهاي حد واسط ديگر و غيره ميباشد.برخلاف آن در مهندسي متابوليک معکوس در ابتدا فنوتيپ مورد نظر شناسايي ميشود،سپس شرايط محيطي يا ژنتيکي که اين محيط را ميدهدمشخص ميشودو در آخر فنوتيپ سلول ميزبان را با دستکاري ژنتيکي تغيير ميدهند.
٤- مهندسي متابوليک در لاکتيک اسيد باکتري ها
لاکتيک اسيد باکتريا به صورت وسيعي در صنايع غذايي تخميري به کار ميروندو بسيار مورد توجه هستند به منظور استفاده از انها به عنوان کارخانه هاي سلولي براي توليد غذا و محصولات دارويي .
تبديل گليکوليتيک قندها به لاکتيک اسيد مسير متابوليکي اصلي است .بين اين باکتري هاي گرم منفيL. lactis
ارگانيسم مدل انتخاب شده به خاطر ژنوم کوچکش متابوليسم ساده و genetic accessibility
در مهندسي متابوليک به سلول زنده نياز است و محصولات هم در سلول زنده توليد ميشوند.
تخمير ميکربي نقش خاصي در صنايع تخميري دارد.شکستن قندها و پروتئين و توليد مقادير زيادي ترکيبات ارگانيک که شامل ترکيبات عطر و طعمي نگهدارنده ها و ...ميباشد .ميکرو ارگانيسم غالب مشخص ميکند که در انتهاي تخمير چه خواهيم داشت براي مثال درتخمير
Saccaromycescerevisiaمحصول نهايي الکل است .Lactobacillus plantranumمحصولاتي با اسيديته بالا ميدهد که بيشترش لاکتيک اسيد است .پروپيوني باکتريوم با توليد پروپيونيک اسيد و استيک اسيد به محصول طعم شيرين و آجيلي ميدهد.
لاکتيک اسيد باکتري هاي هموفرمانتيتيو متابويسم ساده اي دارند که روي تبديل سريع قند به لاکتيک اسيد متمرکز شده . لاکتيک اسيد باکتري ها عموما در مکان هاي با قند بالا ساکن هستند تحت اين شرايط لاکتيک اسيد باکتري متابوليسمي را دارد که قند را خيلي سريع تبديل ميکند و عاري از اکثر فعاليت هاي بيوسنتتيکي است .تحت شرايط نرمال محصول اصلي لاکتيک اسيد است اما محصولات ديگري هم تحت عنوان by-productتوليد ميشوند مثل استيک اسيد ,استالدهيد, اتانول و دي استيل نقش اصلي متابوليسم قند توليد انرژي ضروري براي رشد سريع و براي ثابت نگه داشتن pHداخل سلولي طي اسيدي کردن محيط است .
استفاده اصلي از لاکتيک اسيد باکتري ها بدون شک در صنايع لبني است که از اين ها استفاده ميشود تا شير يا ساير محصولات لبني را به محصولات تخميري بسيار متنوعي تبديل کنند.البته در کنارشير ساير مواد غذايي پروسس نشده مثل گوشت و سبزيجات هم در مقياس صنعتي بوسيله لاکتيک اسيد باکتري ها تخمير ميشوند.اين باکتري ها در شير با لاکتوز به عنوان منبع اصلي کربن مواجه ميشوند اما آنها توانايي استفاده از ديگر سوبستراهايمونوساکاريد و دي ساکاريدي را دارند.محصول اصلي لاکتيک اسيد است که نقش مهمي در محافظت از محصول نهايي نسبت به فساد دارد.علاوه بر اسيدي کردن محيط متابوليسم لاکتيک اسيد باکتري ها براي توسعه يک سري از ويژگي هاي محصول از جمله عطر و طعم طول مدت نگهداري و بافت هم ضروري است .
استارترهاي مهندسي متابوليک که در درگير غير فعال سازي ژن هاي نامطلوب يا overexpressionژن هاي نامطلوب يا جديد است استفاده ميشوند تا مسيرهاي متابوليکي را به جهتي ديگر هدايت کند بوسيله تغيير در متابوليسم انرژي يا غلظت مواد حد واسط متابوليکي يا محصولات نهايي کاملا جديد.
براي رسيدن به اين استراتزي ها ضروري است که مسير هاي کنترل فاکتورها و ژن هاي ديگر را بدانيم .
L. lactisاز گذشته لاکتيک اسيد باکتريي بوده که بيشترين مطالعه رويش انجام شده و طي دهه هاي اخير لوازم ژنتيکي پربازده برايش بوجود آمده که اين ها بسيار براي استراتژي هاي مهندسي متابوليکي که هدفش غير فعال سازي ژن هاي نامطلوب و يا overexpressionکنترل شده ي ژن هاي موجود يا ژن هاي جديد است .مخصوصا سيستم بيان کنترل شده ژن هاي نايسين (NICE)براي بيان ژن هاي همسان و غير همسان در باکتري هاي گرم مثبت ثابت شده که خيلي ارزشمند هستند و اين سيستم NICEبر اساس ويژگي خود تنظيمي بيوسنتز ترکيب ضد ميکربي نايسين است که بوسيله ي بعضي سويه هايL. lactis توليد ميشود.
لاکتيک اسيد باکتري هاي مهندسي متابوليکي شده به عنوان کارخانه هاي سلولي پربازده براي توليد خارج از محل ex situمتابوليتهاي خاص در بيوراکتورها استفاده ميشوند.اين متابوليتها ميتوانند به عنوان افزودني غذايي يا اجزايي از محصولات دارويي باشند.
٥-توليد محصولات مختلف بوسيله مهندسي متابوليک لاکتيک اسيد باکتري ها
١.٥- توليد ويتامين
باکتري هاي لاکتيک اسيد توانايي بيوسنتتيکي محدودي براي توليد ويتامين ها دارند با اين وجود استثنائاتي هم وجود دارد:باکتري ماست :در استرپتوکوکوس ترموفيلوس توليد فوليک اسيد مشاهده شده که رشد ديگر ماست را تحريک ميکندLactococcusbulgaricus.
همچنين L. lactisمقدار قابل توجهي فوليک اسيد طي تخمير توليد ميکند.بسياري ار ژن هاييکه مسير توليد فوليک اسيد را کد ميکند در ژنوم اين باکتري شناسايي شده همچنين ژن هاي توليد ريبوفلاوين (ويتامين B٢)و بيوتين (ويتامين B٦).
توليد ويتامين بوسيله لاکتيک اسيد باکتري ها مزاياي بسيار زيادي طي پروسه هايي که اخيرا استفاده شده داشته (بوسيله باسيلوس يا سودوموناس )طوري که آنها ميتوانند براي توليدات in situاستفاده شوند مثل غذاهاي تخميري .
٢.٥- پروتئوليز
پروتئوليز يک پروسه ي حياتي براي رشد لاکتيک اسيد باکتري ها در شير است .همزمان با افزايش رشد L. lactisدر شير افزايش توليد پروتئيناز مربوط به ديواره سلولي PrtPمشاهده شده .همچنين گزارش شده که در کل پروسه ي شکستن پروتئين ها به پپتيدها و بعد از آن به اسيد آمينه ساختن پپتيدهاي بزرگتر از محيط خارجي به محيط داخليکه بوسيله OPP(oligopeptidtransperter)بيان ميشوديک مرحله ي بسيار سخت در طي رشد L. lactisدر شير است .
عدم توانايي ميوتانت هاي OPPمنفي در رشد در محيط هايي که کازئين به عنوان تنها منبع اسيد آمينه است شکسته شدن کامل اليگو پپتيدها به اسيد آمينه ي تنها در لاکتيک اسيد باکتري ها نتيجه عمل تحريک سري کامل پپتيدازهاي درون سلولي است .اين پپتيدازها سوبستراي مشترک
وهيچکدام از آن ها به تنهايي براي رشد روي اين پپتيدها ضروري نيستند.ژن هايي که پپتيدازهاي داخل سلولي را کد ميکنند به تنهايي و همراه با دو سه چهار و پنج پپتيداز متفاوت قطع ميشوند.فقط زماني که سه پپتيداز يا بيشتر همزمان قطع شود رشد لاکتيک اسيد در شير تحت تاثير قرار ميگيرد.پروتئوليز و به دنبال آن تبديل اسيد آمينه بوسيله لاکتيک اسيد باکتري هايک پروسه ضروري براي توليد عطر در پنيرطي دوره رسيدن است .کوشش بسياري در زمينه مهندسي متابوليک لاکتيک اسيد باکتري هادر سطح پروتئوليز براي بهتر کردن توسعه ي عطر در پنير شده است :بوسيله ي کنترل مستقيم ليز لاکتيک اسيد باکتري ها که نتيجه اش آزاد شدن پپتيدهاي درون سلولي و يا آنزيم هاي تبديلي اسيد آمينه هاست افزايش توليد عطر و طعم مشاهده شد.
٣.٥- توليد دي استيل
توليد رو به افزايش استوئين و استيک اسيد به عنوان يکي از نتايج مهندسي متابوليک اهميت کمي در صنايع غذايي دارد.ام آروماي کره ،دي استيل از نظر شيميايي خيلي شبيه به استوئين است و همچنين طي تخمير لاکتيکي به مقدار کم توليد ميشود.مسير تبديل استوئين رابه يک حد واسط ناژايدار تبديل ميکند به نام α-acetolactateکه ميتواند تجمع يابد و در حضور اکسيژن به دي استيل تبديل شوداين مکانيسمي است که دي استيل در محصولات لبني توليد ميشود.جهت دهي مجدد –متابوليک و دانستن مکانيسم توليد دي استيل يک استراتژي موثر براي توليد دي استيل
بوسيله ي –توسط مهندسي متابوليک ميتواند طراحي شود.از هم گسيختگي LDHيا زياد بيان شدن NOXبه همراه از هم گسيختگي ALDBميتواند نتيجه توليد زياد دي استيل باشد.ترکيب دو ژن قطع شده بوسيله جمع شدن پلاسميدي از نظر تکنيکي بسيار پيجيده است .بنابراين استراتژي زياد بيان شدن NOX از هم گسيختگي همزمان
ALDBانتخاب شده .
اين يک استراتژي بسيار موثر شده که نتيجه اش تبديل بيش از ٥٠% قند در دسترس به آروماي مورد نظر: دي استيل ميباشد.اين مثالي از استفاده از لاکتيک اسيد باکتري هابه عنوان کارخانه هاي سلولي براي توليد ترکيبات غذايي را نشان ميدهد.
٤.٥- توليد شيرين کننده هاي کم کالري
يک مثال موفق در زمينه ي مهندسي متابوليک تبديل قند شير(لاکتوز)به قندهاي الکلي است مثل مانيتول و سوربيتول
.مانيتول توليد شده بوسيله لاکتيک اسيد باکتريها اغلب يا LDHندارد يا LDH کمي دارد، مخصوصا تحت شرايط بي هوازي .
ديگر موادحدواسط مثل هگزوز به جاي پيروات در گليکوليز نقش پذيرنده الکترون را ايفا ميکنند.از اين طريق مانيتول و سوربيتول از طريق احيا فروکتوز ١-فسفات شکل ميگيرند.
Overproductionمانيتول فسفات دهيدروژناز با استفاده از سيستم NICEسبب افزايش مانيتول ميشود.به دنبال آن با استفاده از يک مدل رياضي براي گليکوليز L.lactisميتوان پيش بيني کرد که مقدار مانيتول بيشتري بوسيله گلوگاه متابوليک در فسفرلاسيون مانيتول به دست مي آيد.
بوسيله ي وارد کردن يک فعاليت فسفرلاسيون درL.lactisيک توليد پربازده مانيتول در اين باکتري لاکتيک اسيد توليد شد.يکي از ويژگي هاي مانيتول طعم شيرينش است که قابل قياس با گلوکز است تبديل لاکتوز که اصلا شيرين نيست به مانيتولبه طور خودکار توليد رابه سمت توليد محصولات تخميري شيرين ميبرد.همچنين مانيتول سبب کاهش کالري محصول هم ميشودزيرا مانيتول و ديگر پلي ال ها در بدن انسان تجزيه نميشوند.
يک مثال مشابه ديگر توليد سوربيتول توسط لاکتيک اسيد باکتري L. plantarumاستسوربيتول هيچ وقت به عنوان يک محصول تخميري محسوب نمي شود .اما لاکتيک اسيد باکتري ها ژن هايي دارند که ميتواند سوربيتول را به
عنوان سوبستراي قند مصرف کند براي رشد.بوسيله ي overproduction ژن هاي کننده سوربيتول دهيدروژناز يک سويه ي جديد ايجاد شد که تقريبا ٥٠% از قند(گلوگز) را به سوربيتول تبديل ميکند.
اين جنبه از تبديل قندهاي با کالري بالا به شيرين کننده هاي کم کالري مثل سوربيتول ،مانيتول و آلانين در صنايع غذايي مورد توجه زيادي قرار گرفته است .
٥.٥- توليد عطر و طعم بوسيله ي لاکتيک اسيد باکتري ها
تقريبا تمام دانش مربوط به ليست کردن ترکيبات اسيد آمينه و متابوليسم نيتروژن در لاکتيک اسيد باکتري ها مربوط به مطالعاتي است که ناشي از استفاده از L.lactisوαs١-کازئين طي توليد و همچنين دوره رسيدگي پنير است .
بيشتر لاکتيک اسيد باکتري ها توانايي محدودي براي سنتز آمينو اسيدهاي de novo دارند. لاکتيک اسيد باکتري ها براي رشدشان در شير کاملا به سيستم پروتئوليتيکش وابسته است تا به طور جزئي کازئين را بشکند و اسيد آمينه هاي آزاد مخصوصا پپتيد توليد کند.که اين پپتيدها بوسيله عمل ترکيب وطبقه بندي پپتيدها به اسيد آمينه هيدروليز ميشوند.طي اين پروسه در پنير تعدادي از پپتيدهاي تلخ به عنوان مواد حدواسط توليد ميشوند و مجددا تجزيه ميشوند با اثر مستقيم روي عطر و طعم پنير.بوسيله overproductionپپتيدازهاي خاص در L.lactisمثل آمينوپپتيداز
,(Pep N )N
(X-prolyidipeptidylaminopeptidase)Pep X سطح تجمع اين پپتيدهاي تلخ ميتواند کاهش يابد.اين اثباتي است از اينکه چگونه مهندسي متابوليک ميتواند تاثير مثبت روي توليد عطر و طعم در فراورده هاي لبني تخميري داشته باشد.
تبديل اسيد آمينه هاي آزاد به ترکيبات عطر و طعمي خاص در مرحله بعد پيچيده تر است .ترکيبات عطر و طعمي بسيار گسترده اي در نتيجه ي تبديل اسيد آمينه ها ميتوانند توليد شوند از قبيل متونين ،لوسينو فنيل آلانين .مشخص شده که تفاوت هاي بسيار ظريفي بين هزاران سويه ي L.lactisکه براي توليد ژنير به کار ميروند وجود دارد.
