بخشی از مقاله
مهندسی متابولیک و پدیدههای انتقال
چکیده
سالیان زیادی است که از دستکاری مسیر متابولیکی میکروارگانیسمهای مختلف برای استفاده از متابولیتهای مطلوب آنها استفاده میشود. در حال حاضر نیز برای تولید بسیاری از متابولیتها بر این راهبرد تکیه میشود که به صورت بارز می توان به تولید اسید آمینهها، ویتامینها، حلالها و انواع آنتی بیوتیکها اشاره نمود.در اینجا مهندسی متابولیک را اینگونه تعریف می کنیم: اصلاحات مستقیم در شکل گیری محصول یا خصوصیات سلولی، از طریق تغییرات در واکنش(هایبیوشیمیایی) خاص و یا معرفیِ نوع جدیدی از آن(ها) با استفاده از فناوری DNA نوترکیب.همانند تمامی رشته های مهندسی؛ مهندسی متابولیک نیز دو مرحله را شامل میشود: ٌ- تجزیه و تحلیل ٍ-سنتتیکاز آنجایی که مهندسی متابولیک در سایه فناوری DNA نوترکیب ظهور یافت، ابتدا بر روی قسمت سنتتیک تمرکز میشود. به این ترتیب مهندسی متابولیک مظهر فناوری بیولوژی مولکولی با محتوای مهندسی کمتر است.بخشهای مهم مهندسی را در قسمت تجزیه و تحلیل بررسی میکنیم. در سمت سنتتیک، جنبه ی دیگری از مهندسی متابولیک تمرکز جدیدی بر روی مسیرهای سوخت و ساز یکپارچه به جای واکنشهای منفرد است. به همین دلیل کل شبکه واکنش های بیوشیمیایی از نظر مسیر سنتز و امکان سنجی ترمودینامیکی، همچنین شار مسیر و کنترل آن، بررسی میشود. بنابراین شاهد یک تغییر الگو از واکنشهای منفرد بیوشیمیایی به واکنشهای شبکه ای، در واقع برهمکنش واکنشهای شیمیایی، هستیم. در این زمینه، مفهوم شبکه متابولیک از اهمیت محوری برخوردار میشود. از طریق مهندسی متابولیک، نگرش به جای جدا در نظر گرفتن واکنشها، به سمت کلی دیدن سیستم تغییر یافته است. در این راستا، مهندسی متابولیک به دنبال سنتز و طراحی با استفاده از تکنیک ها و اطلاعات توسعه یافته از همین تحقیقات گسترده برآمده از دید تک واکنش دیدن متابولیسم است و به نوبه خود، مشاهدات در بارهی رفتار کلی سیستم بهترین راهنما برای تجزیه و تحلیل بیشتر و منطقی تر است.
واژههای کلیدی: مهندسی متابولیک، مسیرهای متابولیک، شار، پدیدههای انتقال
ٌ. مقدمه
مهندسی متابولیک عمل بهینه سازی فرآیندهای ژنتیکی ونظارتی در داخل سلولها برای افزایش تولید سلولها از یک ماده خاص می باشد. این فرایندها، مسیرهایی هستند که با استفاده یک سری از واکنش های بیوشیمیایی و آنزیم ها، سلولها مواد خام را به مولکولهای لازم برای بقای سلول تبدیل میکنند. مهندسی متابولیک؛ فرآیند کار با مسیرهای متابولیکی در سلول ها با هدفِ بخشیدن ویژگیهای خاص به آنها است. این کار معمولا با افزایش یک فرآیند متابولیکی است که در حال حاضر
در سلول انجام می شود؛ در اصل میتوان گفت که این کار به منظور بهینهسازی عملکرد سلول برای هدفی خاص است.تکنیک اصلی مهندسی متابولیک، تغییر مسیرهای متابولیکی با استفاده از یک پیام خاص بیوشیمیایی جهت تغییر در شبکه ی ارتباطات داخل سلولی و یا بین سلولی است.
از زمان ظهور تکنولوژی DNA نوترکیب، مهندسی ژنتیک سلولها، به ویژه در میکروارگانیسمها، تجربهی موفقی از پیشرفت در بهوجود آوردن و توسعه سویه هایی با توانایی بالای تولید پروتئینهای نوترکیب و مولکولهای شیمیایی کوچک نشان داده است. اما پس از آن، استراتژی هایی فراتر از مهندسی ژنتیک مورد نیاز است؛ چراکه این متابولیت ها توسط واکنشهای متعدد داخل سلولی سنتز میشوند که توسط فاکتورهای مختلفی از جمله تعادل کوفاکتورها و جریانهای تنظیمی پیچیده میشود.
مهندسی متابولیک به عنوان تغییر هدفمند متابولیسم سلولی، با استفاده از DNA نوترکیب و سایر تکنیکهای بیولوژی
مولکولی، میتواند تعریف شود.
مهندسی متابولیک سیستم سلولی و متابولیکی را بهعنوان یک سیستم کلی مورد بررسی قرار می دهد و بر این اساس امکان دستورزی سیستم با توجه به بهرهوری از فرآیند های زیستی کلی را فراهم میکند؛ که همهی اینها سبب میشود تا مهندسی متابولیک خود را از مهندسی ژنتیک ساده، متمایز کند.
مزیت مهندسی متابولیک نسبت به مهندسی ژنتیک و یا جهش زایی تصادفی، در جنبههای مختلف این است که با توجه به اینکه سلولها مهندسی شده اند، از تغییرات غیرضروری در سلولِ مهندسی شده جلوگیری میشود و تغییرات تنها در مواقعی
که لازم باشند اعمال میشود. در میان نمونههای موفق مهندسی متابولیک، گزارشهای مربوط به تولید کارآمد -L والین،
-L ترئونین، لیکوپن، پیشسازهای داروهای ضد مالاریا و بنزیل سوکینولین آلکالوئیدها نشان دهندهی چگونگی عملکرد
هدفمند مهندسی متابولیک است.
مانند سایر مواد شیمیایی صنعتی مفید، داروها همچنان هدف اصلی مهندسی متابولیک است. متابولیتهای ثانویهی گیاهی که ارزش دارویی دارند؛ مثل آرتمینسیک اسید ، بنزیل سوکینولین آلکالوئیدها و تاکسول، به وسیلهی میکروارگانیسمها با متابولیک مهندسی شده، با موفقیت تولید شده اند. تولید انسولین انسانی بهوسیلهی E.coli نوترکیب، مثال بارزی از فرآورده تولیدی تکنولوژی DNA نوترکیب است، اما پروتئینهای پیچیدهتر که ارزش دارویی زیادی دارند، میتوانند بهوسیله مهندسی متابولیک ارگانیسم ها تولید شوند. ایجاد آنتیبیوتیکهای مختلف از نظر عملکردی و ساختاری به وسیلهی مهندسی متابولیک، اهمیت زیادی در مبارزه با پاتوژنهای نوظهور مقاوم به دارو دارد.
خیلی از داروها و یا پیشساز آنها که در ارگانیسمها یافت میشوند، نسبت به سنتز شیمیایی استخراج آنها در مقیاس بالا نسبتا سخت است.مهندسی متابولیک نقش مهمی در تولید این داروها و پیشساز آنها دارد. این امر معمولا با ایجاد مسیرهای جدید متابولیکی برای تشکیل محصول، القا و یا حذف مسیر متابولیکی موجود برای افزایش تولید محصول، محقق میشود.
پیشرفتهای اخیر در System biology و Synthetic biology امکان انجام مهندسی متابولیک در سطوح مختلف سلولی را میدهد؛ از این رو امکان طراحی بهینه ی میکروارگانیسم برای تولید داروها و یا پیشساز آنها فراهم میشود.
برای نمونه می توان به دو نمونهی موفق از روشهای مهندسی متابولیک که در آن با استفاده از سویهی میکروبی برای تولید آرتیمیسین( داروی ضد مالاریا) و بنزیل سوکینولین آلکالوئیدها از خانوادهی داروهای ضد میکروبی و ضد سرطان؛ و مهندسی سیستمهای متابولیک اشرشیا کولی E.coli برای تولید -L والین( یک پیشساز مهم در تولید داروها) اشاره کرد. باکتری های اسید لاکتیک به عنوان لاکتوکوکوس میکروارگانیسمهای انتخابی برای انجام مهندسی متابولیک در رابطه با تخمیر موادغذایی است . این باکتری به طورگسترده درکارخانجات موادغذایی استفاده میشود، این باکتریها ساده اند و در نتیجه متابولیسم قابل کنترل داشته و ژنتیک مولکولی این باکتریهای مواد غذایی به خوبی توسعه یافته اند. موفقیتهای اخیر در مهندسی متابولیک دراین باکتریها، ازجمله نمونه هایی از تغییرات درهر دو متابولیسم اولیه (دیوآلانین) ومتابولیسم ثانویه هستند.
همچنین وانیلین یکی از مهم ترین طعم در صنعت مواد غذایی است و علاقه زیادی در تولید آن از طریق فرآیندهای بیوتکنولوژی با شروع از بسترهای طبیعی مانند اسید فریولیک وجود دارد .در میان باکتری ها، سویه های نوترکیب اشرشیاکلی کارآمد ترین تولیدکنندگان وانیلین محسوب میشوند، در حالیکه سویه های سودوموناس مسیرهای متابولیک گسترده ای دارند، به سرعت ترکیبات فنولی مختلف از جمله وانیلین را متابولیزه میکند. که پروسه های این مسیرها توسط مهندسی متابولیک بر روی سودوموناسها دستکاری و کنترل میشود.
اهداف bio-fortifying غذاهای گیاهی در محصولات، می تواند توسط مهندسی متابولیک به دست آید، یا با استفاده از تنوع طبیعی یا مهندسی ژنتیک تنظیم شود. مهندسی ژنتیک بالقوه به غنی سازی محصولات غذایی گیاهی به میزان قابل توجهی خطر ابتلا به بیماری های مزمن را کاهش می دهد.
مهندسی متابولیک می تواند درک درستی از نقش غذا های گیاهی در رژیم غذایی را بهبود بخشد. داده ها از مطالعات ارزش غذایی مواد غذایی می تواند اهداف بهبود محصول را تنظیم کند. افزایش ارزش مواد مغذی گیاهی مثل میوه وسبزیجات، ازطریق پرورش و یامهندسی متابولیک، میتواند به سلامت کمک می کند.
افزایش قیمت نفت و نگرانی های زیست محیطی ناشی از استفاده از سوخت های فسیلی توجه همه را به استفاده از زیست توده به عنوان یک منبع پایدار برای تولید سوخت های زیستی جلب کرده است . با این حال ضروریست میکروب هایی با کارایی بالا که قادر به تولید سوخت های زیستی با راندمان بسیار بالا هستند را، به منظور رقابت با سوخت های فسیلی توسعه داد.به تازگی، استراتژی برای توسعه سویه های میکروبی به وسیلهی مهندسی سیستم های متابولیک، که می تواند به عنوان مهندسی متابولیک متصل شده با systems biology و synthetic biology در نظر گرفته شود، یافته اند.Systems metabolic engineering اجازه توسعه میکروب ها بصورت موفق در تولید سوختهای فسیلی مثل بیواتانول، بیوبوتانول، آلکانها و بیودیزل و حتی هیدروژن می دهد.
ٍ. دیدگاه مهندسی شده به متابولیک
پیشرفت های تکنیک های زیست شناسی مولکولی در زمینه DNAنوترکیب بُعد جدیدی از "دستکاری مسیر" را معرفی کرد. از این رو ساختار و پیشینه ی مهندسی ژنتیک به خوبی معرفی شد و مهندسی ژنتیک امکان اصلاح و تغییرات دقیقی در واکنش های آنزیمی خاص در مسیر متابولیکی را فراهم نمود. مدت کوتاهی پس از امکان بهره گیری از تکنیک و فناوری DNA نوترکیب، شرایط مختلف برای نمایش کاربردهای بالقوه این فناوری در تغییرات و اصلاح هدفمند مسیرهای متابولیکی، ابداع شد. برخی از پیشنهادات ارائه شده مثل؛ اصلاح مولکولی، در تکامل شرایط زنده، مهندسی مسیرهای میکروبی یا متابولیک، مهندسی سلولی ، مهندسی های متابولیک.
در مهندسی متابولیک، برای دستیابی به یک هدف خاص به شدت بر استفاده از مواد جهش زای شیمیایی و تکنیک های خلاقانه انتخابی برای شناسایی گونه های برتر تکیه می شود. علیرغم پذیرش گسترده و موفقیتهای چشمگیر، پروفایل ژنتیکی و متابولیکی گونههای جهش یافته به صورت ضعیفی مشخص شده است و فرایند جهش زایی بعنوان یک فرایند تصادفی به صورت یک عنصر هنری کامل کننده علم باقی مانده است.
اگر چه هدفمند بودن ذات کار در تمام برنامه های بهبود سویه است، از این جهت تلاش های مهندسی متابولیک در مقایسه با جهش زایی تصادفی، به نقطه اتکای قویتری دست یافته که نقش غالب را در انتخاب هدف آنزیمی، طراحی آزمایش، تجزیه و تحلیل داده ها، بازی میکند. از سوی دیگر، جهت بهبود سلولی نباید به تغییر و طراحی در مسیرهای معقول تفسیر شود، به این معنی که آن را کاملا از جهش زایی تصادفی مجزا کنیم. در واقع، گونههایی که توسط جهشزایی تصادفی به دست میآیند و خواص فوق العاده ای را نشان میدهند، منبع اطلاعات حیاتی در مورد تنظیمات مسیر و کنترل هستند، می شود از طریق مهندسی متابولیک معکوس اطلاعات مربوطه از آنها استخراج شوند.
اگرچه متابولیسم و فیزیولوژی سلولی، چارچوب اصلی برای تجزیه و تحلیل های مسیرهای واکنشی را فراهم میکند، با این حال باید اشاره کرد که نتایج حاصل از تعیین شار و کنترل، کاربرد گسترده تری دارد. بنابر این علاوه بر تجزیه تحلیل مواد و شار انرژی به دست آمده از مسیر متابولیک، مفاهیم مهندسی متابولیک به همان اندازه، برای کسانی که با مسیرهای انتقال سیگنال روبرو میشوند کاربرد می یابد. شاید مهمترین سهم مهندسی متابولیک تاکید آن بر مکان خود در شار متابولیکی و کنترل آن ها، در شرایط زنده است.
✓ شار(فلاکس) متابولیک
مفهوم شار متابولیک مفهوم جدیدی نیست. شار متابولیک و کنترل آن در واقع حدود چهار دهه مد نظر عدهی خیلی کمی از بیوشیمیستها بود. به عنوان نتیجه کار آنها، ایدههای بر روی کنترل متابولیک بالغ شد و به صورت مشخصی تعریف گردید، اما باز هم مورد توجه بیوشیمیستهای سنتی واقع نشد. ترکیبی از روشهای تحلیلی برای تعیین کمیت شار و کنترل آنها با استفاده از تکنیکهای زیستشناسی مولکولی برای اجرای تغییرات ژنتیکی پیشنهادی، جوهرهای مهندسی متابولیک است.
شار یک تعیین کننده اساسی فیزیولوژی سلول و مهم ترین پارامتر مسیر متابولیکی است . برای مسیر خطی، شکل ٌ. a ، شار آن، J، برابر است با سرعت واکنش منفرد در شرایط پایا. بدیهی است که حالت پایا، زمانیست که متابولیتهای حدواسط به غلظتی میرسند که سرعت تمامی واکنش ها برابر می شود. ( ( v 1 = v 2 =. . .= V L
در طول زمان حالت گذار، سرعت واکنش های منفرد برابر نیست و شار مسیر متغیر و غیرقابل تعریف است ( معمولا با تغییر زمان سرعتهای متفاوت از مصرف سوبسترا و یا تولید محصول به دست میآید).
در شکل ٌ، b، مسیر شاخه ای، در حد واسط I، برای هر شاخه از مسیر دو شار اضافی داریم که رابطه آنها در حالت پایا برابر است با : J1=J2+J3شار هر شاخه برابر است با سرعت واکنشهای منفرد در شاخه مرتبط؛ همانطور که در شکل ٌ، c، نشان داده شده است؛ اغلب راحت تر است که شار J1 را به عنوان شار خطی J2 و J3 در نظر بگیریم. به این ترتیب همانطور که در شکل ٌ، d، مشخص است؛ یک شبکه پیچیده می تواند به تعدادی مسیر خطی که هریک شار مربوط به خود را دارند، تجزیه شود. لازم به ذکر است که برای همه ی مسیر های شکل ٌ، شرط لازم برای رسیدن به حالت پایا این است که سرعت آغاز و پایان واکنش (یا، معادل، به ترتیب غلظت متابولیت های اولیه و نهایی، Aو B، C، و غیره...) باید ثابت باشد. این معمولا با غلظت ثابت یک متابولیت خارج سلولی معین در یک بیوراکتور مداوم انجام می شود که به آن کموستات می گویند.
چون مسیر متابولیکی و شار آن، هسته ی اصلی مهندسی متابولیک به شمار می آید، بنابراین بسیار مهم است که تعریف و معنای مهندسی متابولیک، بسط داده شودمسیر. متابولیک؛ هر توالی ای از مراحل واکنشِ امکان پذیر و قابل مشاهده ی بیوشیمیایی که در ارتباط با مجموعه خاصی از متابولیت های ورودی و خروجی است، تعریف می شود. سپس شار مسیر سرعتی است که متابولیت های ورودی تا تبدیل شدن به متابولیت خروجی، تحت پردازش قرار می گیرند. به اهمیت قابل مشاهده بودن و امکان پذیری باید توجه کرد. در مثال شکل ٌ،d ، اگر شار از هر جهت منجر به تشکیل متابولیت E شود، شار بطور تجربی قابل اندازه گیری و مشخص کردن نیست؛ در اینجا باید دو مسیر به صورت یک مسیر با خط چین نشان داده شود.
تعیین شار متابولیک در شرایط زنده و طبیعی تجزیه و تحلیل شار متابولیک (MFA) نامیده شده است و مرکزتوجه مهندسی متابولیک است.
در این چارچوب ازمسیرهای متابولیک و شار، هدف اساسی مهندسی متابولیک روشن کردن عوامل و مکانیزم های مسئول برای کنترل شار متابولیک است. درک بهتر از کنترل شار، پایه و اساس ایجاد اصلاحات منطقی در مسیر متابولیکی به همراه دارد. سه مرحله در این فرآیند برای بررسی سیستماتیک از شار متابولیک و کنترل آنها وجود دارد . اولین گام، توسعه، این است که تمامی مسیرهای ممکن برای اندازه گیری شار خود در نظر گرفته شوند. برای این منظور، این کار خیلی ساده با اندازه گیری غلظت متابولیت های خارج سلولی آغاز می شود. مثلا در شکل ٌ، d، سنجش متابولیت های A-F از شبکه امکان تعیین ِ شار را نشان می دهد؛ ولی نه برای مسیری که قبل از F جدا می شود. یادآوری این نکته ضروری است که شار یک مسیر متابولیکی همان فعالیت آنزیمی یک یا چند آنزیم در مسیر نیست. در واقع سنجش آنزیمی هیچ اطلاعاتی را در مورد شار واقعی از مسیری دیگر در آزمایشگاه که همان آنزیم در آن حضور و فعالیت دارد، فراهم نمی کند. گنجاندن این اطلاعات در مطالعات متابولیکی اغلب بد تفسیر شده و این شبهه را در ذهن ایجاد می کند که شار متابولیک مقدار مشابهی با فعالیت آنزیمی دارد؛ که به طور قطع ناشی از تفسیر نادرست نتایج به دست آمده است.
گام دوم این است که آشفتگی به خوبی در شبکه واکنش زیستی تعریف شده و شار مسیر پس از گذر از حالت آرامش سیستم به حالت پایدار جدید خود تعیین شود. از آنجا که همه تحقیقات کنترل شار به سرعت در یک نقطه از شاخه خاص متابولیک تمرکز می کنند، برای کنترل شار در مسیر شاخه شماتیک شکل ٍ مناسب است. به طور کلی، برای بررسی نقطه ای از شاخه، ، هر کدام در هر یک از شاخه های متناظرایجاد می شوند، سه آشفتگی مورد نیاز است. اغتشاش ایده آل مربوط به
کموستات خواهد بود، که در آن پس از این که سیستم به یک حالت پایدار رسید، فعالیت آنزیم به طور ناگهانی مختل می شود (برای مثال، از طریق استفاده از پروموتر القایی). این ترتیب بیشتر برای سیستم های میکروبی و کشت سلولی کاربرد دارد. برای انواع دیگر از سیستم های مانند گیاهان و عملکرد عضو در حالت طبیعی تنظیمات تجربی متفاوت مورد نیاز است. انواع دیگری از آشفتگی که راحت تر پیاده سازی می شوند وجود دارند، از جمله افزودن یک سوبسترا و یا تعویض به یک منابع کربن مختلف نیز می تواند اطلاعات خوبی به ما بدهد. اگر چه هر اغتشاش دیگر با اثر قابل ملاحظه ای بر روی شار شاخه متناظر باید قابل قبول باشد؛ آشفتگی باید نسبت به آنزیم های نزدیک به شاخه را هدف قرار داده. در نهایت، باید توجه داشت که یک اغتشاش می تواند اطلاعات مربوط به بیش از یک شاخه را فراهم کند، و این کار برای به حداقل رساندن تعدادی از آزمایش های مورد نیاز برای روشن کردن ساختار کنترل شبکه متابولیسم مفید است.
شکل ٍ. مسیرهای مختلف شار متابولیک.
گام سوم و نهایی در تعیین کنترل شار تجزیه و تحلیل نتایج اغتشاش شار است . واضح است که اغتشاش شار از هر یک از سه شاخه از شکل . 2 امکان یافتن انعطاف پذیری نقطه ی شاخه خاص را می دهد. برای مثال، اگر یک اغتشاش بزرگ از شار J1 هیچ اثر قابل ملاحظه ای در مقدار و یا توزیع دو شار دیگر (نسبت شار تقسیم) نداشته باشد، پس بدیهی است که با توجه به آشفتگی های بالادست، یکی در برخورد با یک نقطه شاخه است که انعطاف پذیر نیست. در چنین مواردی تلاش برای تغییر شار پایین دست با تغییر فعالیت آنزیم های بالادست بیهوده خواهد بود. دو شاخه ی دیگر را می توان به همین ترتیب تجزیه و تحلیل کرد. درک چگونگی اغتشاش شار مهم است ، شروع از طریق تغییر در سرعت یک واکنش (القایی)، معرفی شار بزرگتر در کل مسیر (پالس سوبسترا)، یا سایر روش ها، به نوبه خود از طریق نقطه شاخه و شبکه انتشار می یابد. آشفتگی آغاز شده در یکی از شاخه های از طریق شبکه متابولیت منتشر می شود. به عنوان مثال، افزایش شار J1 ممکن است یک تغییر قابل توجهی در غلظت متابولیت I از نقطه شاخه ایجاد کند یا نه، نشان می دهد که به نوبه خود، درجه ای از کنترل توسط شار در آن سطح متابولیت اعمال شده است . از سوی دیگر، حتی اگر I تغییرکند، ممکن است تاثیر اندکی بر شارJ2 و J3 داشته باشد؛ مخصوصا اگر در حالت پایدار، دومی شدیدا تنظیم شده و یا تحت تاثیر اندکی از غلظت متابولیت I باشداین. یکی از سناریوها است که درِ تجزیه و تحلیل کنترل شار را از نقاط شاخه و شبکه های متابولیک گشوده است. اهمیت روشن کنترل شار ناشی از این واقعیت است که هر طراحی کنترل شار، استراتژی های مختلفی را برای تقویت شار و یا تغییر در نسبت تقسیم شار تعیین می کند. درک کنترل شار متابولیک از هدف های کلیدی مهندسی متابولیک است. کنترل فلاکس میتواند به بهترین شکل در یک چهارچوب آنالیز حساسیت که به طور کمّی درجهی کنترل به کارگرفتهشده در هر فلاکس مسیر را توصیف میکند، تحلیل و آنالیز شود. آنالیز کنترل متابولیکی ( (MCA ابزاری را جهت توصیف حد کنترل محلی (آنزیمی) و کنترل کلی (سیستمیک) اعمالشده توسط یک آنزیم منفرد یا فاکتورهای مؤثر بر روی فعالیت آنزیم فراهم میسازد. در چهارچوب MCA، رابطه بین سینتیک آنزیمی محلی با کنترل فلاکس مسیر کلی امکانپذیر است و بنابراین عملکرد سیستمیک یک شبکهی متابولیکی را از روی ویژگیهای تنظیمی و سینتیک واکنشهای منفرد سازنده مدلسازی میکند.
✓ پدیده های انتقال در مهندسی متابولیک
تلاشها در به دست آوردن تخمینهای شارهای متابولیکی، ضرایب کنترل، قابلیت انعطاف آنزیمی و پارامترهای دیگر از
سیستمهای بیولوژیکی سادهشدهی ژنتیکی استفاده میکنند. چنین جهشیافتههایی در مسیرهای رقابتی نقص دارند که اجازه
میدهد شارها به طور مستقیم از نرخ زمان تغییر تعداد بسیار کمی از متابولیتهای خارجسلولی اندازهگیری شوند. اگر چه این -
رویکرد برخی نتایج جالب را نیز به دنبال داشته است، معمولاً به تعدادی از دلایل تا اندازهای محدود میشود. ایجاد جهش
یافتههای سادهشده همیشه کار آسانی نیست، آنها اغلب رفتار متفاوتی را از خود بروز میدهند و به هیچ وجه ارتباط
مسیرهای مشاهدهشده در این سیستمهای تغییریافته را با مسیرهای سیستم اصلی روشن نمیسازند. رویکردی که در این جا
میآید، مطالعهی سیستم بیولوژیکی تغییرنیافته، اما تکمیلشده با بسیاری از سنجشها و اندازهگیریها به صورتی است که
تجهیزات اجازه میدهند. بدین طریق، کمیتهای شارهای متابولیکی و مشتقشان از مدلسازی شبکهی متابولیکی برای
بهترین توصیف از سرعت و برچسبزدن به اندازهگیریهای متابولیتی به دست میآیند. با درست کردن درجهی قابل توجهی
از فراوانی در فرآیند تعیین فلاکس، در واقع این سطح اطمینان که آنها بیانگر فلاکس واقعی در محیط طبیعی هستند به
طور قابل ملاحظهای افزایش مییابد.
در برخی طرق، میتوان شباهت بین تعیین فلاکس و مشخصات ساختاری ماده برقرار نمود. در علم مواد، هیچ روش واحدی -
وجود ندارد که ساختار کامل مادهی مورد بحث را فراهم نماید. در عوض، تعدادی از تکنیکهای مختلف به کار گرفته می
شوند و ساختار آن ماده را به صورتی که بهترین توافق بین اندازهگیریهای آزمایشگاهی و مدلسازیشان از ساختارهای
مفروض ماده برقرار نماید، تعیین میکند. به طور مشابه، از شبکهی مفروض بیوشیمیایی آغاز شده و فلاکس به گونهای
تعیین میشود که تعداد زیادی از اندازهگیریهای چندبعدی، مستقل و پراکنده با بهترین مطابقت با پیشبینیهای ساختار
مفروض بیوشیمیایی باشند.
این مسئله حائز اهمیت است که در آغاز سیستم آزمایشگاهی توصیف شود که رویکرد قبلی بسیار کاربردپذیر میباشد. چنین
سیستمی متشکل از یک بیورآکتور پیوسته است که در آن کشت سلولی یا میکروبی ب خوبی رشد میکند و به یک وضعیت
پایا میرسد. سنجش متابولیتها در خوراکدهی و در پایان رآکتور تخمینهای دقیقی از نرخهای متابولیکی تولید و مصرف
متابولیتهای اصلی را ارائه میکندازاین. گذشته، میتوان مستقیماً به درون رآکتوری با پالسهای دقیقاً مشخص از
سوبستراهای برچسبدار عرضه نمود که توسط سلولها برداشته شده و به شکلهای مختلف مجدداً در محصولات ترشحشده
نمایان میشوند. آنالیز درجهی غنیسازی در محصولات نهایی و نیز ساختار ریز پیکهای متابولیتی در طیف رزونانس
مغناطیسی هسته (NMR) ترکیب قدرتمندی را برای وضوع بیشتر فلاکسهای متابولیکی فراهم میسازد.
مفهوم امکانپذیری ترمودینامیکی بر مبنای بزرگی و علامت تغییر انرژی آزاد گیبس استاندارد برای واکنشهای منفرد به
مسیرهای واکنشی تعمیم مییابد. باید توجه داشت که تا حدی محدودیت وجود دارد که مقادیر مثبت تغییرات انرژی آزاد
گیبس استاندارد میتواند توسط اختلافها در غلظت متابولیت غلبه گردد. همان طور که تعداد واکنشها با ΔGº مثبت
افزایش مییابد، اختلاف غلظت کلی که برای غلبه بر ΔGº بسیار مثبت نیز افزایش مییابد. اگر محدودیتهای ویژه بر روی غلظتهای کمینه که در یک مسیر متابولیکی مجاز بودهاند تحمیل شوند، مراحل واکنش یا یک مجموعه از مراحل میتوانند به صورت مراحل غیرممکن از لحاظ ترمودینامیکی تعریف شوند بدین معنی که مانع ترمودینامیک با اختلال بیشتر یا موضع - یابیشده در مسیرهای متابولیسمی را ایجاد میکننداگرچه. موانع ترمودینامیکی لزوماً با محدودیتهای کینتیکی ارتباطی ندارند، این احتمال وجود دارد که به همراه آنالیز ترمودینامیکی اطلاعاتی راجع به موانع سینتیکی به دست آیند. این امر از طریق استفاده از مفاهیمی از ترمودینامیک و ترمودینامیک برگشتپذیر، انجام میگیرد.
