بخشی از مقاله
چکیده
فلور باکتریایی پنیر مهمترین عامل در خصوصیات توصیفی حسی آن می باشد. هدف از این مطالعه ، جداسازی و شناسایی باکتریهای اسید لاکتیک بالقوه موجود در پنیر های سنتی نیشابور که عطر و طعم را تحت تاثیر قرار می دهند بود. یکی از اهداف عمده شناسایی فلور میکروبی در فرآورده های لبنی سنتی ، تولید صنعتی فرآورده هایی با ویژگی های عطری و طعمی مشابه فرآورده های لبنی بومی است.
بدین منظور نمونه های مختلف پنیر های سنتی نیشابور با منشا شیر گاوی و گوسفندی مورد بررسی قرار گرفتند. باکتریهای جدا شده از این نمونه ها بوسیله روش های مرفولوژیکی شناسایی شده و با تعیین توالی ناحیه 16S ریبوزومیDNA ،تایید گردیدند. فراوانترین جنس های خانواده باکتریهای اسید لاکتیک ، جدا شده از نمونه های پنیر بترتیب عبارت بودند از : انتروکوکوس - - %62,962 ، لاکتوباسیلوس - - %25,925 ، استرپتو کوکوس - - %7,407 و لویکونستوک . - %3,703 - نتایج بدست آمده از ارزیابی حسی نشان داد که باکتریهای لاکتوباسیلوس هلوتیکوس و لاکتو باسیلوس گسری در ایجاد عطر و طعم مطلوب نقش داشته اند. از نتایج بدست آمده از این تحقیق میتوان در فرمولاسیون استارتر های بکار رفته در ساخت پنیرهای صنعتی استفاده کرد .
مقدمه
باکتریهای اسیدلاکتیک بهطور وسیعی در طبیعت پراکندهاند و نیازهای تغذیهای آنها بسیار پیچیده است.بنابراین آنها ساکنان غالب مواد غذایی که غنی از کربوهیدرات، پروتئین تجزیه شده، ویتامینها و شرایط با اکسیژن تقلیل یافته اند،بوده و به همین دلیل در فرآوردههای لبنی یافت میشوند. خصوصیات ارگانولپتیک از قبیل عطر و طعم سبب افزایش تقاضای مصرف پنیر میشود لذا صنعت جدید پنیرسازی به دنبال پنیری نیست که برای ماهها قابلیت نگهداری داشته باشد، بلکه خواهان محصولی است که خواص ارگانولپتیک مطلوب داشته و در نتیجه در سریعترین زمان ممکن به فروش برسد .[1] به همین دلیل شناسایی باکتریهایی که قادر به ایجاد خواص حسی مطلوب تر در پنیر هستند در حال حاضر اهمیت بیشتری پیدا کرده است.
بعضی از میکروارگانیسمها به علت داشتن آنزیمهای معینی، نقش آغازگر را در تولید فرآوردههای لبنی دارند و در صورت اضافه نمودن آنها به شیر، فرآوردههای لبنی تولیدی دارای عطر و طعم ویژه شده و بازارپسندی بیشتری پیدا میکنند. لذا در کارخانجات صنعتی تولید پنیر ، میکروارگانیسم های مذکور در بخشی از فرآیند تولید به شیر اضافه شده و سپس شیر تبدیل به فرآوردههایی مثل پنیر میگردد. [2 ]
به خاطر اهمیت مسئله بهداشت و جلوگیری از بیماری ، از شیر پاستوریزه در تولید پنیر استفاده میشود. بنابراین فلور طبیعی موجود تحت تاثیر حرارت در شیر از بین میرود و در صورتی که بخواهیم از این شیر، پنیر درست کنیم، باید باکتریهای اسیدلاکتیک را به شیر بطور دستی اضافه کنیم. این باکتریها که از قبل مشخص شدهاند، کشت آغاز گر را تشکیل میدهند.[3] این استارترکالچرها، شامل همه باکتریهائی که به طور طبیعی در شیر بودهاند، نیستند.
لذا عطر و طعم پنیرهای سنتی که در آنها از فلورباکتریایی طبیعی موجود در شیر استفاده شده، متفاوت با عطر و طعم پنیرهای صنعتی است که در آن شیر پاستوریزه بکار رفته است. در ایران برخی پنیر های سنتی از مقبولیت بالایی برخوردارند که از آن جمله میتوان به پنیر لیقوان اشاره کرد.[4] با توجه به اینکه باکتریهای اسیدلاکتیک توانایی تجزیه ترکیبات شیر به ترکیبات فرار و معطر را دارند به همین منظور میتوانند نقش مهمی در تکوین طعم و آرومای پنیر داشته باشند [5] .هدف از مطالعه حاضر شناسایی فلور لاکتیکی پنیر های سنتی نیشابور بوده است.
مواد و روش ها
دوازده نمونه یک کیلو گرمی پنیر سنتی از دو نوع گاوی و گوسفندی، حاصل از شیر خام با دوره رسیدگی 3 ماهه - خرداد تا مرداد ماه - از بخش های شش گانه شهرستان نیشابور - از هر بخش یک نمونه پنیر گاوی و یک نمونه گوسفندی - تهیه شد برای این که مراحل تولید در همه موارد یکسان و بطور مشابه صورت گیرد ،مجری طرح نظارت بر مراحل تولید داشت. نمونه ها در محلول سالین رقیق شدند - از 0,1 تا - 0,001 ، سپس به محیط کشت MRS-Agar منتقل گردیدند و در دمای 37 درجه برای مدت 36-72 ساعت اینکوبه شدند.
کلنی های متفاوت از هر پلیت بطور تصادفی انتخاب شده و جهت دستیابی به کلنی خالص چندین بار روی محیط کشت MRS آگار پاساژ داده شدند . سپس از نظر شکل ظاهری ، تست کاتالاز و تست رنگ آمیزی گرم، ایزوله ها مورد بررسی قرار گرفتند. باکتریهای ایزوله شده در محیط MRS براث کشت داده شده و پس از سانتریفوژ و شستشوی رسوب با بافر نمکی فسفاته استریل ، در 200 میکرولیتر محلول ساکاروز 15 درصد استریل ، لیوفلیزه گردیده و در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند .[6]
استخراج DNA
جهت استخراج DNA از کشت 24 ساعته سویه های منتخب ، ابتدا به رسوب سلولی شستشو داده شده ، 300 میکرولیتر از محلول بافر لیز کننده - حاوی 50 میلی مولار سوکروز ، EDTA و 25 میلی مولار Tris-HCL با pH=8 - و 10 میکرولیتر آنزیم لیزوزیم با غلظت 10 - mg/ml - اضافه گردیده و به مدت 15-10 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری گزدید بقیه مراحل استخراج توسط کیت بایونیره کره - Bioneer, Daejeon 306-220, Korea - و طبق دستورالعمل ارائه شده انجام گرفت . کیفیت DNA استخراجی توسط ژل الکتروفورز %1 و دستگاه اسپکتروفتومتر مورد ارزیابی قرار گرفت. [6]
تکثیر قطعه 16SrDNA و شناسایی باکتری ها
جهت تکثیر ناحیه 16SrDNA ، از پرایمر فوروارد : 5'- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3' و پرایمر معکوس 5'- CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT -3' یونیورسال استفاده گردید7 ]،[8 ، علت استفاده از پرایمر های مذکور این بود که این پرایمر ها مخصوص جنس باکتریهای اسید لاکتیک است و با استفاده از آنها مطمئن شدیم که گونه های جدا شده از جنس باکتریهای اسید لاکتیک بوده اند و تشخیص در سطح گونه منوط به تعیین توالی خواهد بود.
پرایمر های ذکر شده نوکلئوتید های 1 تا 1498 ناحیه 16S ریبوزومی DNA باکتریهای اسید لاکتیک را تکثیر نمود. واکنشهای PCR طی شرایط ذیل انجام گرفت: دمای 95 درجه سلسیوس برای مدت 2 دقیقه و در ادامه 35 سیکل شامل دمای 95 درجه سلسیوس برای 45 ثانیه، 53 درجه سلسیوس برای 45 ثانیه و 72 درجه سلسیوس برای 60 ثانیه و یک سیکل نهایی 73 درجه سلسیوس برای مدت 3 دقیقه - . - 22 محصول PCR پس از الکتروفورز از روی ژل آگاروز بریده شد و توسط کیت استخراج از ژل - - Bioneer, Daejeon 306-220, Korea جدا شد. قطعه استخراج شده پس از تعیین غلظت برای تعیین توالی به شرکت - Gttingen, Germany - Seqlab ارسال شد. نمونههایی تعیین سکونس شده با کتابخانه ژنوم مرکز بینالمللی اطلاعات بیوتکنولوژی - NCBI - مقایسه وBlAST گردیدند. مشابهت بالای %97 به عنوان همان گونه تلقی شد و باکتریها در حد گونه شناسایی شدند.
ارزیابی حسی
ارزیابی حسی پنیر ها توسط گروه پانل 16 نفره و با روش مقیاس درجه بندی همزمان با آزمونهای میکروبی انجام شد . فاکتورهای مورد ارزیابی شامل رایحه، طعم ، رنگ و قابلیت پذیرش کلی محصول بود و از عبارات توصیفی خیلی خوب ، خوب ، مورد قبول ،بد و خیلی بد استفاده گردید و جهت انجام آزمون آماری به ترتیب به آنها امتیاز های 5، 4، 3، 2 و 1 اطلاق گردید.[9]
طرح آماری
نتایج بدست آمده سپس توسط نرم افزار SAS ودر قالب طرح کاملا تصادفی به روش فاکتوریل 6×2 با استفاده از دوسطح پنیر - منشاء گاوی و گوسفندی - و 6 ناحیه در 3 تکرار مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. مقایسه میانگینها به روش دانکن انجام شد و نمودارها توسط نرم افزار EXEL رسم شدند.
نتایج ارزیابی مرفولوژیک
ایزوله ها از نظر تست کاتالاز ، رنگ آمیزی گرم و مرفولوژی طبق جدول شماره 2 مورد ارزیابی قرار گرفتند. طبق جدول شماره 1 از تعداد 27 ایزوله 20 ایزوله کوکسی و 7 ایزوله باسیل است که 16 ایزوله از کوکسی ها مربوط به پنیر های گوسفندی و4 ایزوله گاوی است . از تعداد 7 ایزوله باسیل هم 5 ایزوله مربوط به پنیر گاوی و 2 ایزوله گوسفندی است.
