بخشی از مقاله
چکیده:
کشت و کار برخی گیاهان در شرایط برون شیشه اي و مزرعه به دلیل شرایط سخت تولید، کاهش عملکرد ناشی ازشیوع آفات و بیماري هاي ویروسی و قارچی و سایر عوامل، مشکل و در بعضی موارد مقرون به صرفه نیست. به همین منظور طی چند دهه اخیر استفاده از روشهاي بیوتکنولوژي به ویژه روش کشت درون شیشهاي افزایش یافته است. این علم درتولید ارقام جدید، تکثیر گیاهان سخت ازدیاد و همچنین در حفاظت از گونه هاي نادر و کم یاب و در حال انقراض نقش کلیدي داشته است.
اما براي اینکه بتوان از این تکنیک درسطح تجاري براي هرگیاه استفاده کرد، نیازبه آزمون و خطا دارد که این مرحله درآزمایشگاه هاي تحقیقاتی انجام می شود. ولی روند پیشرفت و گسترش این تکنیک به خاطر هزینه بالاي مواداولیه باسرعت آهستهتري پیش می رود. به همین منظور دراین پژوهش به منظور کاهش هزینه محیطهاي کشت آماده درراستاي تجاري سازي این تکنیک درداخل کشور، درآزمایش اولیه ومقدماتی، از یک ترکیب مختلف نمک هاي نانو به عنوان محیط جایگزین و مقرون به صرفه استفاده شد
درطی این بررسی درتیمار اول ترکیبی از نمک هاي نانو - پتاسیم23٪، کلسیم14٪، منیزیوم6٪، فسفر18٪، نیتروژن25٪ وسوپرمیکرو11عنصره - به عنوان غلظت پایه استفاده شد و درتیمارهاي دوم تا ششم به ترتیب از غلظت هاي 0/5، 0/25، 0/05، 0/02 و 0/01 برابر غلظت پایه استفاده شد. همچنین محیط کشت MS به عنوان محیط کشت شاهد درنظر گرفته شد.
ریزنمونه هاي برگی بنفشه آفریقایی - Saintpaulia ionatha - در تیمارهاي ذکر شده کشت شد و میزان نکروز شدن و برآورد هزینه هاي هر تیمار محاسبه شد. درپایان آزمایش نتایج نشان داد که تیمار پنجم با انگیزش کالوس و تورم بافت جهت تولیدشاخساره, بهترین عملکرد را داشت که هیچگونه نکروزه شدن بافت دراثر مسمومیت درآن مشاهده نشد. همچنین میزان کاهش هزینه ها به میزان 3600 برابر درصورت جایگزینی این تیمار با محیط کشت آماده MS فراهم می شود.
مقدمه
کشت و کار برخی گیاهان در شرایط برون شیشه اي و مزرعه به دلیل شرایط سخت تولید، کاهش عملکرد ناشی ازشیوع آفات و بیماري هاي ویروسی و قارچی و سایر عوامل، مشکل و در بعضی موارد مقرون به صرفه نیست. به همین منظور طی چند دهه اخیر استفاده از روشهاي بیوتکنولوژي به ویژه روش کشت درون شیشهاي افزایش یافته است.
این علم درتولید ارقام جدید، تکثیر گیاهان سخت ازدیاد، تولید متابولیتهاي ثانویه، ایجاد گیاهان تراریخته، تکثیر از بخش هاي رویشی گیاهان، تولید گیاهان عاري از ویروس، تولید انبوه و با کیفیت گیاهان باغی مثل خرما، موز، آناناس، سیب زمینی، نیشکر،کاساوا، سیب زمینی شیرین، یام و سایردرختان میوه، گیاهان زینتی و پوششی، سبزي ها و گیاهان دارویی و همچنین در حفاظت از گونه هاي نادر و کم یاب و در حال انقراض نقش کلیدي داشته است.
درحالی که روش هاي ازدیاد درون شیشه اي نقش مهمی در تجاري سازي گیاهان، ایجاد اشتغال و ارز آوري دارد؛ ولی به دلیل هزینه زیاد موادغذایی، کمبود مهارت، تخصص وتجربه کافی، توسعه و تحقیق در این زمینه محدود گردیده است
هزینه زیاد مواد غذایی و محیط کشت هاي آماده، موادمنعقدکننده، هیدرات هاي کربن، هورمون ها، ویتامین ها، تجهیزات، الکتریسیته و نیروي کارگري باعث شده که محققان درپی استفاده از ترکیبات و تجهیزات جایگزین جهت کاهش هزینه هاي کشت درون شیشه اي در راستاي تجاري سازي این تکنیک جهت تولید انبوه براي همه محصولات کشاورزي گردند
به همین منظور در این مطالعه سعی براین شده که تا با استفاده از کود هاي نانو ارزان قیمت، در دسترس و تولید داخلی به جاي نمک هاي گران قیمت و محیط کشت هاي آماده، هزینه کشت درون شیشه اي را کاهش داد. استفاده از ترکیبات نانو به عنوان بستر کشت جایگزین تا به حال مورد استفاده قرارنگرفته است و استفاده از ترکیبات نانو درکشت هاي درون شیشه اي محدود به یکسري کاربردها, مانندخاصیت گندزدایی واستریل کنندگی آن می باشد. فعالیت ضدقارچی, ضدباکتریایی و ضدویروسی ترکیبات نانونقره , - Shahverdi et al.2007 - نانوتیوبهاي کربن , - Kang et al 2007 - - CNTs - دي اکسیدتیتانیوم نانو - - Lin - nTiO2 and Xing 2007 - نانواکسیدروي - , - Apperlot et al 2009 - - ZnO فولرن هاي کربن - C60 - و ترکیبات دیگرکه بصورت نانو درضدعفونی کردن محیط هاي کشت وریزنمونه هاي کشت مورد استفاده قرار می گیرد, مدت هاست که ثابت گردیده است.
مواد و روش ها:
موادگیاهی
ریزنمونه هاي مود نظر ازبرگ هاي گیاه مادري بنفشه آفریقایی - Saintpaulia ionatha - گرفته شد که هیچ گونه علائم ناشی از تخریب ونکروزه دربرگها وجو نداشت. اندازه هرریزنمونه حدود . /5cm × . /5 cm بود.
استریل کردن
برگ هاي بالغ ابتدا به مدت 30 ثانیه در الکل 70 درصد غوطه ور شدند. سپس سه بار با آب مقطر شستشو و پس از آن به مدت 10 دقیقه در وایتکس 20 درصد ضدعفونی و در نهایت 3 مرتبه آبکشی شدند.
آماده کردن محیط کشت
در این آزمایش به منظور تهیه محیط کشت جایگزین از نمک هاي نانو شرکت سپهر پارمیس استفاده شد. در محیط کشت پایه 51/1 گرم در لیتر از ترکیب کودي شامل پتاسیم 23 - ٪ - ، کلسیم 14 - ٪ - ، منیزیوم - 6٪ - ، فسفر - 18٪ - ، نیتروژن 25 - ٪ - و 2گرم ازکودسوپرمیکرو - 11عنصره - استفاده شد - . - T1 علاوه بر محیط کشت پایه، غلظت هاي کمتر از محیط کشت پایه به عنوان تیمارهاي T2 الی T6 بر اساس جدول یک در نظر گرفته شد.
این میزان کودي درواقع جایگزین نمک هاي ریز و درشت مغذي متداول مورد استفاده درکشتهاي درون شیشه اي بود. محیط کشت شاهد محیط کشت MS - شرکت سیگما - بود. به تمامی محیط هاي کشت به میزان 7gl-1 آگار، 30gl-1 ساکارز و 2ml-1 بنزیل آدنین اضافه گردید. پس از کشت ریزنمونه ها در شرایط 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در دماي 24 درجه سانتی گراد نگهداري شدند. از همان روز ابتداي کشت، صفاتی مانند میزان کالوس زایی ، باززایی و نکروزه شدن بافت ها ثبت شد.این طرح به صورت کاملا تصادفی با سه تکرار اجرا شد.
جدول :1 میزان غلظت نمک هاي نانوي مورد استفاده جایگزین درکشت درون شیشه اي بنفشه آفریقایی
نتایج و بحث
نکروزه شدن دراثر مسمومیت
نتایج نشان داد که مدت زمان بروز علایم نکروزشدن ریزنمونه ها دراثر مسمومیت درتیمارهاي مختلف متفاوت بود؛ بطوریکه سریعترین - 30دقیقه پس ازکشت - وآهستهترین - 420دقیقه پس ازکشت - نکروزه شدن به ترتیب درتیمارهاي T1 و T4 اتفاق افتاد. جذب بسیار بالاي این کود به خاطر ماهیت نانوبودن باعث ایجاد مسمومیت و نکروزه شدن بافتهاي گیاهی شد که این موضوع استفاده ازغلظت هاي کمتر ازغلظت معمول را موجب شد.
به همین منظور به تدریج باکاهش غلظت جهت دستیابی به غلظت مناسب، میزان نکروزه شدن نیز کاهش یافت بطوریکه درتیمار هاي دوم، سوم و چهارم نکروزشدن به ترتیب 90، 120 و 420 دقیقه پس ازکشت رخ داد و درنهایت بهترین غلظت مربوط به تیمارهاي T5و T6 بود که هیچ گونه مسمومیت و نکروزه شدن درآنها رخ نداد و بین تیمار پنجم و ششم بهترین عملکرد مربوط به تیمار 0/02 - T5 درصد غلظت محیط پایه - بود که فاقدهرگونه علایم مسمومیت و نکروزگی بود.
