مقاله گسترش طیف ضد میکروبی لیزوزیم از طریق اتصال کووالان به سدیم دکستران سولفات

بخشی از مقاله

چکیده

امروزه تولید پروتئین هایی با ویژگیهاي عملکردي جدید به یک موضوع اقتصادي و جالب توجه تبدیل شده است. هدف از این تحقیق اتصال دکستران سولفات به لیزوزیم از راه واکنش مایلارد و بررسی خواص ضد میکروبی آن در محیط کشت می باشد. براي دستیابی به این هدف، مخلوط لیزوزیم ودکستران سولفات با نسبت هاي وزنی مختلف 1 - میلی گرم لیزوزیم به ازاي 1، 2، 3 و 5 میلی گرم دکستران سولفات - در دماي 60˚C و رطوبت نسبی 79 درصد به مدت یک هفته قرار داده شد.

نتایج حاصل ازSDS-PAGE و کروماتوگرافی تبادل کاتیونی، اتصال لیزوزیم به دکستران سولفات را تأیید کرد و همچنین اندازه گیري قند کل نمونه هاي کانژوگه نشان داد که بیشترین مول پلی ساکارید اتصال یافته مربوط به نسبت 1 به 5 می باشد. بنابراین با استفاده از کروماتوگرافی تبادل کاتیونی لیزوزیم کانژوگه شده - نسبت 1 به - 5 خالص سازي گردید و براي اندازه گیري قدرت ضد میکروبی آن علیه باکتري گرم منفی Escherichia coli و باکتري گرم مثبت Staphilococcus aureus استفاده شد.

نتایج حاصل از بررسی اثر ضد میکروبی کانژوگه حاصل نشان داد که لیزوزیم کانژوگه شده توانست به اندازه 1/1 سیکل لگاریتمی از چمعیت باکتریاییE. coli بکاهد در حالیکه در مورد S. aureus احتلاف معنی داري با آنزیم اصلاح نشده نشان نداد. بنابراین کانژوگه حاصل می تواند در فرمولاسیونهاي غذایی و دارویی به عنوان یک عامل ضد باکتریایی مؤثر به کار برده شود.

مقدمه

ویژگیهاي سطحی پروتئین ها - نظیر آبگریزي و بار - نقش مؤثري در رفتار بیوکاتالیستی آنها دارند. تکنیک هاي بسیاري به منظور اصلاح سطح آنزیم و در نهایت ویژگیهاي عملکردي آنها پیشنهاد شده است که به طور معمول از اتصال کووالان مولکولهاي خاص به سطح آنزیم استفاده می شود که از بین مولکولهاي متفاوتی که به عنوان اصلاح کننده به کار برده می شوند گلیکوزیدها به ویژه پلی ساکاریدها - با توجه به گزارشات متعدد در ارتباط با بهبود ویژگیهاي عملکردي آنزیم - در مرکز توجه می باشند . - 1 -

لیزوزیم یک آنزیم آنتی باکتریال می باشد که کاربرد گسترده اي در صنایع غذایی و داروسازي دارد و در منابع مختلفی از قبیل سفیده تخم مرغ، بزاق، اشک و شیر موجود می باشد و قادر به هیدرولیز باندهاي گلیکوسیدي بین کربن شماره یک -Nاستیل مورامیک اسید وکربن شماره چهار -Nاستیل گلوکز آمین موجود در دیواره سلولی باکتري هاي گرم مثبت می باشد - 2 - و از آنجاییکه این دیواره در باکتریهاي گرم منفی توسط لایه لیپو پروتئین/لیپو پلی ساکارید احاطه شده است، این باکتریها در برابر آنزیم از خود مقاومت نشان می دهند محدود بودن طیف عملکردي آنزیم به باکتریهاي گرم مثبت باعث شده است که تحقیقات گسترده اي در این راستا صورت گیرد تا این آنزیم تبدیل به یک عامل ضدمیکروبی مؤثر و یک نگهدارنده معمول غذایی شود . - 3 -

هدف از این تحقیق اصلاح آنزیم به طریق واکنش مایلارد و تولید کانژوگه لیزوزیم و سدیم دکستران سولفات به نسبت هاي مختلف و در نهایت بررسی اثر ضدمیکروبی بهترین نسبت آنزیم اصلاح شده بر علیه باکتري اشریشیا کلی و استافیلوکوکوس اورئوس به ترتیب به عنوان نماینده باکتریهاي گرم منفی و مثبت می باشد.

مواد

لیزوزیم سفیده تخم مرغ از شرکت Anovatech کانادا، سدیم دکستران سولفات - MW~5000 - ، دیواره سلولی باکتري میکروکوکوس لیزودکتیکوس از شرکت Sigma آمریکا تهیه و سفادکس CM-25، محیط هاي کشت Plate count agar و Nutrient broth از شرکت مرك آلمان خریداري شد.

روشها

لیزوزیم و دکستران سولفات با نسبت هاي وزنی مختلف 100 - میلی گرم لیزوزیم به ازاي 100، 200، 300 و 500 میلی گرم سدیم دکستران سولفات - در 12 میلیلیتر آب مقطر حل شد وپس از لیوفیلیزاسیون، پودر حاصل در دماي 60˚C به مدت یک هفته در حضور بروماید پتاسیم اشباع به منظور تأمین رطوبت نسبی %79 قرار داده شد. یک نمونه کنترل - بدون دکستران سولفات - نیز تحت همین شرایط قرار داده شد تا تأثیر یک هفته حرارت دهی را نیز بررسی شود.

الکتروفورز SDS-PAGE مطابق با روش - 1970 - Laemmli با استفاده از ژل جداکننده اکریل آمید 10 درصد و ژل بالایی 3 درصد صورت پذیرفت . - 4 - کانژوگه هاي لیزوزیم-دکستران سولفات بوسیله کروماتوگرافی تبادل کاتیونی با استفاده از ستون5×10 - CM-Sephadex 25 سانتی متر - از لیزوزیم هاي اصلاح نشده جدا شدند . - 5 - لیزوزیم اصلاح شده پس ازجمع آوري و رسوب با سولفات آمونیوم 60 درصد به منظور جداسازي پلی ساکارید هاي اصلاح نشده، لیوفیلیز شد و براي بررسی هاي بعدي مورد استفاده قرار گرفت میزان قند کل نمونه ها با استفاده از روش فنل- سولفوریک اسید انجام شد - 6 - و تعداد مولهاي دکستران سولفات اتصال یافته به یک مول لیزوزیم با در نظر گرفتن وزن مولکولی دکستران سولفات - 5000 - و لیزوزیم - 14600 - محاسبه شد.

فعالیت لیزوزیم با استفاده از روش Imoto - 1968 - انجام گرفت . - 7 - تأثیر گلیکوزیلاسیون بر فعالیت ضد میکروبی لیزوزیم، با نگه داري مخلوط حاوي0/5ml از بافر فسفات سدیم با غلظت 400μg/ml از آنزیم اصلاح شده، طبیعی و حرارت دیده به 4/5ml از محیط حاوي 105 جمعیت باکتریایی در دماي 37˚C به مدت 5 ساعت و شمارش کلی باکتریها بررسی شد . - 3 -

بحث ونتیجه گیري

باندهاي گسترده موجود در نتایج مربوط به الکتروفروگرام SDS-PAGE نشاندهنده اتصال کوالان لیزوزیم به دکستران سولفات می باشد که با افزایش نسبت سدیم دکستران سولفات به لیزوزیم، درجه گلیکوزیلاسیون نیز افزایش می یابد و باندها گسترده تر دیده می شوند که بالاترین درجه گلیکوزیلاسیون مربوط به نسبت 1:5 می باشد . - 8 -

نتایج حاصل از کروماتوگرافی تعویض کاتیونی نشان داد که با افزایش نسبت سدیم دکستران سولفات به لیزوزیم ارتفاع پیک مربوط به نمونه اصلاح شده بیشترمی شود - تصاویر مربوط به کروماتوگرافی ارائه نشده است - . همچنین با توجه به نتایج مربوط به اندازه گیري میزان قند کل، بیشترین مول اتصالی به لیزوزیم 1/16 - مول به ازاي هر مول لیزوزیم - مربوط به نسبت 1 به 5 پروتئین به پلی ساکارید به دلیل وجود بالاترین میزان گروههاي کربونیل شرکت کننده در محیط واکنش می باشد بنابراین از این نسبت به منظور بررسی فعالیت ضد میکروبی کانژوگه استفاده شد.

نتایج مربوط به فعالیت آنزیمی نشان داد که اصلاح لیزوزیم با دکستران سولفات به دلیل ممانعت فضایی گروههاي پلی ساکارید، منجر به کاهش فعالیت آنزیمی به میزان 47 درصد نسبت به لیزوزیم معمولی می شود. نمودار 1 تأثیر گلیکوزیلاسیون را بر فعالیت ضد میکروبی لیزوزیم را نشان می دهد. همانطور که مشاهده می شود لیزوزیم اصلاح شده به طور مؤثرتري 1/1 - سیکل لگاریتمی - نسبت به لیزوزیم اصلاح نشده 0/2 - سیکل لگاریتمی - باعث کاهش جمعیت باکتري E.coli می شود در صورتیکه در مورد S.aureus کاهش قابل توجهی در جمعیت باکتریایی نسبت به آنزیم طبیعی و حرار ت دیده مشاهده نگردید.