بخشی از مقاله
مقدمه
استفاده از داده هاي مولکولی براي مطالعه نحوه پیدایش، گسترش وفرآیند رشد - کاهش اندازه یا حجم جمعیتها در سالهاي اخیر از اهمیت ویژه اي برخوردار شده و به صورت یک روش معتبر و مفید مطرح شده است(7 و .(9
در مورد گونه ها یا زیرگونه هایی که میانگین عمر آنها از شروع پیدایش یا زمان حضور آنها در نیمکره شمالی کره زمین بیش از حدود 20000 سال تخمین زده می شود، این نوع مطالعات از اهمیت و حساسیت بیشتري برخوردار است، چرا که دوره هاي مختلف حداکثر یخبندان جهانی و دوره هاي بین یخبندان بدون شک بر روي سرنوشت موجود مورد مطالعه تأثیر چشمگیر و مؤثري داشته و تخمین زمان پیدایش، یافتن مکان پناهگاههاي (Refuges)
موجود ودرك راهها و مسیرهاي مهاجرت بدون شک
بایستی با در نظر گرفتن این موضوع اساسی انجام شود 4)، 7 و .(12
موش دم کوتاه مقدونیه ( Mus Petrov and Ruzic, 1982 (macedonicus گونه اي از موشهاي آزاد زي است که به ندرت به انسان نزدیک شده و اقدام به همزیستی با انسان می کند. این جونده بیشتر در مزارع، باغات و حومه شهرها دیده شده و با آسیب زدن به زمینها و محصولات کشاورزي به عنوان یک آفت مهم به شمار میرود. گسترش جغرافیایی این گونه به صورت پراکنده از اروپاي غربی و اطراف کوههاي آلپ گزارش شده ولی گسترش اصلی آن مربوط به جنوب شرق اروپا و خاور نزدیک است به طوري که به وسیله کوههاي بالکان و دریاي مدیترانه از غرب، کوههاي قفقاز از شمال وصحراهاي عربستان از
289
M. macedonicus
M. macedonicus spretoides
مجله پژوهشهاي جانوري (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
جنوب محدود شده است. گسترش آن به سمت شرق تا زاگرس و حتی در استان قزوین گزارش شده است 1) و (6 ولی محدوده شرقی آن بخوبی مشخص نیست 5)، 7 و .(9 اخیراً مطالعات مولکولی اندکی بر روي این گونه انجام شده و نتایج نشان دهنده وجود حداقل دو زیرگونه از این جانور است:
یکی است که به وسیله
Orth و همکاران در 2002 در محدوده شرق مدیترانه گزارش شد و دیگري ما بقی محدوده گسترش این گونه
است که به وسیله محققین مذکور
macedonicus خوانده شد(.(9 این محققین 7) و (9
پیشنهاد کردند که احتمالاً دو پناهگاه متفاوت براي این گونه درغرب گرجستان یا در شرق آذربایجان وجود داشته و پس از آخرین یخبندان جهانی از این نواحی گونه شروع به کلونیزاسیون مناطق مختلف کرده و قلمرو امروزه را در اختیار گرفته است. این مطالعه با افزودن تعدادي نمونه از منتهی الیه شرقی قلمرو این گونه یعنی مناطق غربی ایران سعی دارد که محدوده گسترش به سمت شرق به وسیله این گونه را مشخص کند و در مورد صحت نظریه محققین پیشین در مورد منشأ کلونیزاسیون و پناهگاهها بررسی بیشتري انجام دهد.
کامل جانور با روش کلاسیک بهینه شده فنل- کلروفرم استخراج شد (12) و از نظر کیفیت و غلظت به وسیله الکتروفورز با ژل آگارز 1/5 درصد بررسی شد. ناحیه D-Loop از ژنوم میتوکندري به اندازه 856 نوکلئوتید از نوکلئوتید 15430 تا 16286 به وسیله پرایمرهاي استفاده شده در مطالعه (12) با استفاده از مقدار 40-50 نانوگرم از
DNA و حجم 30 میکرولیتر از محلول PCR متشکل از : 1/5 میلی مولار MgCl2 ، 2 میلی مولار dNTP و مقدار
1/5 میکرومولار از هر کدام از پرایمرها و مقدار 0/3
میکرولیتر آنزیم Taq پلیمراز(( 5 U / μl تکثیر شد. شرایط دما و مدت زمان تکثیر عبارتند از : مدت 5 دقیقه در دماي
94 درجه سانتی گراد براي شروع و 35 سیکل شامل 94
درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، 56 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه و 72 درجه سانتی گراد به مدت 1 دقیقه و در نهایت 72 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه به عنوان مرحله پایانی در نظر گرفته شد. محصول به دست آمده از PCR به وسیله آنزیم EXO-SAP تخلیص شد و جهت انجام سکانس و تعیین ترادف به مؤسسه کوثر دانش ارسال شد. در مطالعه حاضر تعداد 17 هاپلوتیپ جدید از سه استان مورد مطالعه براي اولین بار شناسایی و گزارش شدند که در NCBI با شماره هاي HM235682 تا
HM235698 ثبت شدند.
مواد و روشها
نمونه ها: تعداد 22 نمونه موش مقدونیه یا Mus
macedonicus از استانهاي همدان، آذربایجان شرقی و آذربایجان غربی به وسیله تله شکار شدند و پس از تشریح مقداري از کبد و لوزالمعده آنها در لوله هاي 2سی سی و بقیه لاشه در ظروف جداگانه در داخل الکل 70 درصد قرار داده و به آزمایشگاه جهت مطالعه منتقل شدند. محل، موقعیت جغرافیایی و تعداد نمونه ها از هر منطقه در شکل
1 و جدول 1 نشان داده شده است.
PCR و تعیین ترادف: از کبد نمونه هاي داخل الکل ژنوم
290
مرتب کردن ترادف نوکلئوتیدي و آنالیز داده ها:
سکانسهاي انجام شده به وسیله CLUSTAL W که در برنامه نرم افزاري (15) Mega 5 تعبیه شده است، انجام شد و بررسی و مرتب کردن نهایی به صورت دستی انجام شد.
براي در نظر گرفتن تأثیر مناطق اشباع شده احتمالی ومناطق حفاظت شده در ژنوم میتوکندري بهترین مدل استفاده شده که به وسیله نرم افزار(10) Modeltest تعیین شده بود به صورت TVM+I+G در نظر گرفته شد. تنوع نوکلئوتیدي p
، هاپلوتیپی h به وسیله نرم افزار (13) DNASP 4 تعیین شد. آزمون عدم انطباق یا Mismatch و همچنین آنالیز
AMOVA براي بررسی ساختار جمعیتها به وسیله نرم افزار
مجله پژوهشهاي جانوري (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
(2) Arlequin 3 با در نظر گرفتن گاما برابر 0/05 و پارامتر دادن چند نمونه از Mus musculus domesticus و Mus
Kimura 2 انجام شد. درخت فیلوژنتیکی پیوند همجواري musculus musculus , Mus musculus gentilulus و Mus
(Neighbor-Joining ) نیز به وسیله برنامه Mega 5 با قرار spretus به عنوان گروه Outgroups ترسیم شد.
شکل -1 نقشه مناطق نمونه برداري در این پژوهش و نمونه هاي برگرفته از بانک ژنی مربوط به منابع ذکر شده در جدول .1 علائم به شکل مثلث نمایانگر نمونه هاي اختصاصی این پژوهش و علائم به شکل دایره مربوط به داده هاي بانک ژنی است.
جدول -1 جزئیات مربوط به نمونه هاي گونه Mus macedonicus مربوط به این پژوهش و داده هاي گرفته شده از بانک ژنی که در این پژوهش مورد بررسی قرار گرفته اند به همراه اطلاعات مربوط به محل صید، تعداد، طول و عرض جغرافیایی محل صید ( اطلاعات طول و عرض جغرافیایی براي داده هاي بانک ژنی در مطالعات ذکر شده قابل دسترسی است).
شماره استان شهر تعداد مطالعه طول عرض
نمونه جغرافیایی جغرافیایی
1 همدان همدان 4 این پژوهش 48° 30` 34° 48`
2 همدان فامنین 8 این پژوهش 49° 35° 6`
3 همدان ملایر 4 این پژوهش 48° 48` 34° 18`
4 آذربایجان شرقی مراغه 2 این پژوهش 46° 24` 37° 26`
5 آذربایجان غربی سلماس 4 این پژوهش 44° 47` 38° 12`
6 گرجستان 23 Orth et al. 2002 et al. 2007 & Macholan
7 بلغارستان 19 Macholan et al. 2007
8 سوریه 5 Macholan et al. 2007
9 روسیه 2 Macholan et al. 2007
10 ترکیه 13 Macholan et al. 2007
11 یونان 9 Macholan et al. 2007
12 اسرائیل 11 Orth et al. 2002
13 لبنان 2 Macholan et al. 2007 & Orth et al. 2002
14 ایران 15 Macholan et al. 2007 & Gunduz et al. 2000
291
مجله پژوهشهاي جانوري (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
شکل - 2 درخت پیوند همجواري یا Neighbor- Joining از تمام هاپلوتیپهاي مطالعه شده در این پژوهش، علائم مربوط به هر گروه از
هاپلوتیپها در کادر پیوست زیر نشان داده شده است. براي گروه خارجی (Outgroup) از چهار نمونه گونه مختلف استفاده شده است: Mus
musculus musculus, Mus musculus domesticus , Mus spretus و Mus musculus gentilulus
292
مجله پژوهشهاي جانوري (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
جدول-2 نمایانگر جمعیتها، تنوع ژنتیکی، تعداد نمونه براي هر یک از جمعیتهاي مطالعه شده، تنوع نوکلئوتیدي، تعداد متوسط تفاوت نوکلئوتیدي در صد نوکلئوتید، Tajima D و. Fu`s Fs
