بخشی از مقاله
مقدمه
کاروتنوئیدها رنگیزه هاي ایزوپرونوئیدي محلول در چربی میباشند و در طبیعت به وفور یافت میشوند. این ترکیبات عامل رنگهاي سبز، زرد، قرمز و نارنجی در برگهاي گیاهان، میوهها، گلها و حیوانات مانند پرندگان، حشرات، ماهیها وسختپوستان می باشند .(5) کاروتنوئیدها رنگدانههایی هستند که معمولاً در گیاهان، جلبکها و باکتریهاي فتوسنتتیک، به دلیل نقش حیاتی آنها در فرآیندهاي فتوسنتزي یافت میشوند. همچنین این رنگدانه-
ها در بعضی از باکتریهاي غیر فتوسنتزي، مخمرها و کپکها نیز به عنوان آنتی اکسیدانت و پایدارکنندة غشاهاي سلولی و به منظور حفاظت در برابر آسیبهاي ناشی از نور و اکسیژن تولید می شوند .(8) حیوانات قادر به تولید این رنگدانهها نیستند و آنها را از رژیم غذایی دریافت میکنند.
کاروتنوئیدها در حیوانات باعث رنگی شدن آنها شده و در بدن آنها بعنوان آنتی اکسیدانهاي بیولوژیک و پیش ساز ویتامین A فعالیت میکنند (9) و علاوه بر دفاع درونی بدن در مقابل استرسهاي اکسیداتیو، در حفاظت بدن در مقابل بیماریها و پدیده پیري نیز نقش دارند 2) و .(17
تاکنون 700 کاروتنوئید مختلف شناسایی شده است (7) و
در حال حاضر این رنگیزه ها به عنوان مواد افزودنی مجازغذایی اهمیت ویژه اي پیدا کرده اند .(15) بیوسنتز کاروتنوئیدها در میکروارگانیسم ها نیز مورد مطالعه قرار گرفته است .(6) در این پژوهش کاروتنوئیدهاي تولید شده توسط سویه Haloarcula sp. IRU1 بررسی گردیده است.
این سویه متعلق به آرکیهاي بسیار نمک دوست است و از آب دریاچه ارومیه جداسازي و شناسایی شده است .(1)
کلونیهاي این آرکی به دلیل حضور پیگمان کاروتنوئیدي قرمز و نارنجی هستند. معمولاً پیگمانتاسیون آرکیهاي نمک دوست منجر به تولید کاروتنوئیدهاي قرمز- نارنجی رنگ، غالباً با ساختار 50 کربنه با نام باکتریوروبرین می گردد 10)
و .(11 در این مطالعه، ابتدا رنگدانههاي کاروتنوئیدي
میکروارگانیسم مورد نظر به ویژه فراوانترین کاروتنوئید موجود در آن تخلیص و تا حد امکان شناسایی گردید.
سپس به منظور تعیین ساختار پیگمان کاروتنوئیدي اصلی این سویه از روشهاي اسپکتروفتومتريUV ، TLC ، NMR
واسپکتروفتومتري جرمی استفاده گردید.
مواد و روشها
آرکی و محیط کشت: در مطالعه قبلی سویه مورد بررسی از آب دریاچه ارومیه جداسازي شده و با روشهاي
استاندارد میکروبیولوژیکی، بیوشیمیایی و توالی یابی
مورد شناسایی قرار گرفته و در بانک ژنی
NCBIبا شماره HM625751.1 به ثبت رسیده است. این
جدایه به صورت لیوفیلیزه در آزمایشگاه ملی
میکروبیولوژي صنعتی دانشگاه الزهرا(س) نگهداري
می شود. طبق آزمایشات صورت گرفته توسط شیرزاد بهینه سازي شرایط رشد این آرکی اکستریموفیل انجام شده است. بنابراین در این تحقیق، محیط کشت مناسب و با
شرایط بهینه به دست آمده براي رشد
IRU1 مورد استفاده قرار گرفت .(1) براي تهیه یک لیتر محیط کشت از این مواد بر حسب گرم استفاده شد: 250 NaCl، MgCl2.6H2O 34/6، MgSO4.7H2O 49/4،
Yeast extract 5 ،CaCl2 .2H2O 0/92، NaBr0 /58،
KCl0/5، .NaHCO3 0/17 همه مواد از شرکت Merck تهیه شده است.
براي تهیه این محیط کشت، نمکهاي اصلی محیط کشت شامل NaCl ،MgCl2.6H2O وMgSO4.7H2O، در یک ارلن
و سایر مواد محیط کشت که شامل نمکهاي با درصد پایین
و عصاره مخمر میباشند، در یک ارلن دیگر، به طور مجزا، پس از اضافه کردن نیمی از آب مورد نیاز و تنظیم pH
محیط بین 6/8 - 7 و رساندن به حجم نهایی، در دماي
120 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شده و
327
vacuum evaporator
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
سپس بلافاصله در شرایط استریل با هم مخلوط شدند. پس از تلقیح میکروارگانیسم، محیط کشت تهیه شده به نسبت یک به ده در چند ارلن مایر تقسیم شده و به مدت چهار روز در انکوباتور شیکردار با شرایط دماي 47 درجه سانتی گراد و 200 دور در دقیقه قرار داده شد. پس از این مدت، محیط کشت حاوي باکتري، ابتدا در لولههاي فالکون، به مدت 20 دقیقه و با 11000 × g سانتریفیوژ شد و پس از دور ریختن مایع رویی، رسوب حاصله توسط آب نمک
15 درصد به صورت سوسپانسیون درآمد و مجدداً سانتریفیوژ گردید. سپس بیومس باکتریایی جمع آوري و در فریزر -20 درجه سانتی گراد نگهداري شد.
تعیین بیومس آرکی: محیط کشت این سویه حاوي مقادیر زیادي نمک می باشد، بنابراین براي تعیین وزن بیومس خالص آرکی، نیاز به برآورد میزان رسوب نمکی می باشد که احتمالاً در هنگام سانتریفیوژ کردن همزمان با بیومس حقیقی رسوب می کند. بدین منظور حدود 100 میلی لیتر محیط کشت حاوي آرکی و 100 میلی لیتر محیط کشت فاقد آرکی که داراي تمام شرایط محیط کشت حاوي آرکی بود، در لوله هاي فالکونی که از قبل وزن آنها اندازه گیري شده بود سانتریفیوژ شدند. پس از خارج کردن محلول رویی، مجدداً فالکونها توزین شده و با کم کردن وزن رسوب نمک به دست آمده در فالکون حاوي محیط کشت فاقد باکتري از وزن به دست آمده از رسوب حاصله از فالکون حاوي محیط کشت واجد آرکی، وزن دقیق بیومس آرکی محاسبه گردید. براي تعیین وزن خشک آرکی فالکون حاوي بیومس به مدت 72 ساعت در آون 70 درجه سانتی گراد قرار داده شد. پس از این مدت، وزن رسوب خشک به دست آمده، اندازه گیري گردید.
شکستن دیواره سلول و استخراج عصاره کاروتنوئیدي:
میزان مشخصی از بیومس آرکی درون یک لوله شیشه اي سرپوش دار ریخته شد و تقریباً به اندازه سه برابر وزن بیومس، به آن پودر شیشه نرم اضافه گردید. پس از افزودن
استون به بیومس و پودر شیشه، به مدت پنج دقیقه ورتکس شد. سپس لایه رویی جمع آوري و مجدداً به رسوب باقیمانده استون اضافه گردید و عمل ورتکس کردن تکرار شد تا بیومس به طور کامل بی رنگ گردد. پس از انتقال کامل پیگمانها به استون، محلول حاصل به مدت ده دقیقه و با 11000 × g سانتریفیوژ شد تا ذرات پودر شیشه و باقی مانده سلولهاي باکتري متلاشی شده از محیط خارج شوند.
سپس به حجم محلول استون جمع آوري شده، هگزان اضافه گردید و به منظور جدا کردن دو فاز از یکدیگر، شستشو توسط آب مقطر انجام شد. این کار چندین بار تکرار گردید تا استون به طور کامل از هگزان جدا شده و تمامی پیگمانها به لایه هگزان منتقل شدند. به لایه رویی جمع آوري شده نمک سولفات سدیم بدون آب اضافه شد تا آب باقی مانده در محیط به طور کامل گرفته شود. براي تأیید روش انجام شده براي استخراج پیگمانها، این مراحل در شرایط مشابه سه بار تکرار گردید و هر بار بلافاصله جذب محلول توسط دستگاه اسپکتروفتومتر و در طول موج 490 نانومتر خوانده شد.
اندازه گیري مقدار کل کاروتنوئیدها: براي تعیین میزان کل کاروتنوئیدهاي استخراج شده مراحل کار تا مرحله استخراج در هگزان انجام شده و حجم هگزان یادداشت گردید. سپس با اسپکتروفتومتر جذب آن را در طول موج
490 نانومتر خوانده و با توجه به فرمول زیر غلظت کاروتنوئیدها بر حسب میکروگرم در هر گرم وزن خشک باکتري محاسبه گردید:
Total carotenoid (μg/g of biomass) = (ml of acetone) × (A490) ×10000 / 2500 × (biomass dry weight)
پس از استخراج کاروتنوئیدها در هگزان، محلول حاصل
توسط دستگاه به طور کامل تغلیظ
گردید. سپس عصاره باقی مانده در حجمی از استون که به اندازه حجم هگزان به کار رفته بود، حل شد. طیف جذب نوري محلول حاوي عصاره کاروتنوئیدي به دست آمده در
328
UV-Visible ، FT-IR ،
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
هگزان، در ناحیه طول موجهاي 300 - 600 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر ثبت شد و نقاط جذب ماکزیمم آن به دست آمد.
جداسازي و شناسایی پیگمانها: پس از تهیه عصاره کاروتنوئیدي، به منظور جداسازي و شناسایی پیگمانها روش کروماتوگرافی با لایه نازك (TLC) با استفاده از تعدادي مارکر استاندارد کاروتنوئیدي شامل بتاکاروتن، آستاگزانتین، کانتاگزانتین و زئاگزانتین به کاربرده شد. براي تهیه صفحات TLC از پلیتهاي شیشهاي و پودر سیلیکاژل
60F254 مرك استفاده شد. پلیتها با ضخامت 300 میکرون و توسط دستگاه مخصوص تهیه گردید. سپس براي فعال سازي صفحات TLC، پلیت هاي تهیه شده به مدت یک ساعت در آون با دماي 100 درجه سانتی گراد قرارداده شدند. به منظور انجام کروماتوگرافی، ابتدا محلول کاروتنوئیدي توسط vacuum evaporator به طور کامل تغلیظ شد و عصاره روغنی باقی مانده در مقدار بسیار کمی استون حل گردید. سپس مقداري از نمونه توسط لوله مویین برداشته شده و به فاصله یک سانتیمتري از انتهاي پلیت بر روي صفحه TLC قرار داده شد و بلافاصله درون تانک کروماتوگرافی که داراي حجمی از حلالهاي استون و پترولئوم اتر به ترتیب با نسبت 65 : 35 بود، به مدت تقریباً 45 دقیقه قرار داده شد. لازم به ذکر است که براي انجام کروماتوگرافی حلالهاي مختلف با نسبتهاي متفاوت مورد استفاده قرار گرفت. این حلالها شامل اتیل استات- بنزن، استون - بنزن، متانول- کلرفرم و استون-
پترولئوم اتر بود، که در این میان، بهترین الگوي جداسازي مشاهده شده، با استفاده از استون و پترولئوم اتر و به ترتیب با نسبت 65 : 35 به دست آمد. پس از این که حلال به انتهاي صفحه TLC رسید و لکه ها به طور کامل از یکدیگر تفکیک شدند، پلیت از تانک کروماتوگرافی خارج و بلافاصله RF تمامی لکه ها محاسبه گردید. در مراحل بعدي و به منظور مقایسه مارکرهاي موجود با لکه هاي مشاهده شده، هر یک از استانداردهاي بتاکاروتن،
آستاگزانتین، کانتاگزانتین و زئاگزانتین، به طور جداگانه و همزمان با نمونه حاوي عصاره کاروتنوئیدي بر روي صفحات TLC قرار داده و با همان نسبت حلالها کروماتوگرافی شدند.
تخلیص کاروتنوئید اصلی با استفاده از روش :TLC پس
از انجام کروماتوگرافی و جداسازي پیگمانها و آشکار شدن باندهاي متعدد ، به منظور انجام آنالیزهاي بیشتر و تا حد امکان شناسایی دقیق تر، قوي ترین و بزرگترین باند مشاهده شده، از روي صفحه TLC برداشته شد. بدین منظور بلافاصله پس از خارج کردن پلیت از تانک کروماتوگرافی، ناحیه باند مورد نظر از روي صفحه TLC
جمع آوري شد و فوراً درون ویالهاي حاوي استون ریخته شد. در ادامه، ویالها ورتکس شده و سپس در دستگاه میکروفیوژ به مدت پنج دقیقه و با 15000 × g سانتریفیوژ گردیدند. بلافاصله پس از خارج کردن ویالها، محلول رویی توسط پیپت پاستور از روي رسوب پودر سیلیکاژل برداشته شد و به ظرف دیگري منتقل گردید.
اندازهگیري مقدار کاروتنوئید اصلی: پس از تخلیص و جمع آوري محلول استون حاوي کاروتنوئید اصلی، محلول حاصل کاملاً تغلیظ شد. سپس عصاره باقی مانده، مجدداً در حجمی از استون که به اندازه حجم هگزان به کار رفته در مرحله استخراج کل پیگمانها براي میزان مشخصی بیومس بود، حل گردید و جذب آن در طول موج 490
نانومتر خوانده شد. سپس مقدار تقریبی این کاروتنوئید بر حسب میکروگرم در هر گرم وزن خشک باکتري محاسبه گردید.
آنالیز و شناسایی کاروتنوئید اصلی: براي آنالیز پیگمان کاروتنوئیدي تخلیص شده با روش کروماتوگرافی با لایه
نازك، از روشهاي طیف سنجی
MS و NMR استفاده شد.
329
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
طیف سنجی :UV-Visible در این مطالعه، با کمک دستگاه اسپکتروفتومتر، نقاط ماکزیمم جذب کاروتنوئید اصلی در ناحیه طول موجهاي 300 – 600 نانومتر اسکن شده و با طیف حاصل و نقاط ماکزیمم جذب به دست آمده از کاروتنوئید باکتریوروبرین و مشتقات نزدیک آن در حلال استون، در منابع موجود مقایسه گردید 10) و .(18
طیف سنجی :FT-IR براي گرفتن طیف پیگمان خالص سازي شده، از عصاره خشک به دست آمده دیسک KBr
تهیه شد و طیف حاصل با طیف مربوط به کاروتنوئید باکتریوروبرین و مشتقات نزدیک آن در منابع موجود مقایسه گردید 10) و .(18
طیف سنجی جرمی: در این تحقیق، اسپکترومتري جرمی (EI MS) براي تعیین وزن مولکولی پیگمان کاروتنوئیدي مورد نظر مورد استفاده قرار گرفت.
طیف سنجی :NMR براي گرفتن طیف H-NMR، عصاره کاروتنوئید مورد نظر کاملاً خشک شده و با حلال کلروفرم دوتره در دستگاه 500 NMR مگاهرتز، طیف آن رسم گردید.
نتایج
آرکی مورد مطالعه یک میکروارگانیسم هوازي میباشد. در صورت تهیه محیط کشت آن در حجم یک به ده در ارلن مایر، باکتري از سرعت رشد بالاتري برخوردار بوده و در زمان کمتري به حداکثر رشد خود میرسد، که این زمان چهار روز میباشد. در طی این مدت رنگ محیط کشت کدر شده و به رنگ قرمز – نارنجی تغییر پیدا میکند. پس از سانتریفیوژ کردن محیط کشت حاوي باکتري و جمع آوري بیومس به دست آمده، میزان بیومس 8/2 گرم در لیتر محاسبه شد. وزن خشک بیومس حاصل نیز، پس از قرار دادن در آون 70 درجه سانتی گراد و به مدت 72
ساعت، 0/17گرم در هر گرم از بیومس تر محاسبه شد.
اولین مرحله براي استخراج پیگمانهاي کاروتنوئیدي، شکستن دیواره سلولی میکروارگانیسم میباشد. این آرکی اکستریموفیل که توانایی زیستن در غلظت بالاي نمک را دارد، حداکثر تا نیم ساعت قادر به تحمل فشار اسمزي پایین آب مقطر میباشد و بیشتر سلولها بلافاصله متلاشی میشوند. البته در روند استخراج کاروتنوئیدها از این باکتري، استفاده از آب مقطر و سپس اضافه کردن حلال، شرایط چندان مطلوبی ایجاد نمیکرد و ترجیحاً از این کار صرفنظر شد. در این تحقیق، ابتدا سعی بر این بود که شکستن سلول و استخراج پیگمانها توسط متانول صورت گیرد. متانول به تنهایی حلال بسیار خوبی براي استخراج پیگمانهاي کاروتنوئیدي از این باکتریها محسوب میشود
.(4) البته این مشکل وجود داشت که در مرحله بعد با اضافه کردن حلال هگزان و شستشو با آب مقطر، مقدار قابل توجهی از کاروتنوئیدها تمایل زیادي به متانول از خود نشان میدادند و انتقال آنها از متانول به هگزان به خوبی اتفاق نمی افتاد. البته در صورت انجام تکانهاي شدید، در نهایت لایه متانول به طور کامل بیرنگ میشد، ولی مقداري از پیگمانها به شکل ذرات تودهاي شکل قرمز رنگ از محیط خارج شده و بین دو لایه قرار میگرفتند.
