بخشی از مقاله
براي تضمین تولید مواد غذایی و دارویی در آینده و توسعه کشاورزي و صنعت، حفظ ذخایر توارثی موجود در طبیعت بکر و دست نخورده، امري ضروري است. بی شک تاریخچه تکامل طولانی میکروارگانیسم ها و تواناییهاي متابولیکی گسترده شان و نقش مهمی که در چرخه عناصر، پالایش زیستی، تولید آنتی بیوتیک ،تولید فرآورده هاي تخمیري و خوراکی، همزیستی با گیاهان، بیابان زدایی و افزایش حاصلخیزي خاك و.... ایفاء می کنند، اصلی ترین دلایل اهمیت بررسی تنوع زیستی میکربی بوده است(.(28 امروزه یکی از شاخصهاي سلامت هر زیستبوم و پایداري آن، تنوع میکروارگانیسمهاي آن در نظر گرفته می شود. بهطوري که زیستبومهاي با تنوع
کمتر، محیطهایی در معرض خطر، حساس و نیازمند مراقبت خاص محسوب میشوند. رفتارهاي انسانی و یا عوامل طبیعی که زیستبومها را به سوي کاهش تنوع میکربی آن هدایت میکنند، می توانند منجر به تخریب زیستبوم و یا بروز همهگیریها و آفتها شوند 2) و .(17
یکی از چالشهاي عمده در تعیین تنوع زیستی میکروارگانیسمها، مشکل جداسازي آنهاست . رایجترین روش براي شناسایی انواع میکروارگانیسمها، تهیه کشت از نمونه خاك، آب، رسوب و رشد روي محیط جامد حاوي ترکیبات مغذي است که انواع مختلفی از میکروارگانیسمها روي آن قادر به رشد هستند. در طول سالهاي اخیر، بررسی
۴۴
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
تنوع زیستی پروکاریوتها با روشهاي مولکولی، بیشتر بر اساس تکثیر ژن 16S rRNA و تعیین توالی ژنی سویهها انجام شده است ﴿(5 آنچه که روشهاي وابسته به کشت از جامعه میکربی نشان میدهند بخش بسیار کوچکی از جامعه میکربی است که توان سازگاري بیشتري با شرایط کشت مصنوعی داشته اند که نمی توان آنها را نمونه شاخصی از وضعیت کلی دانست اما توسعه روشهاي کشت به خصوص جایی که گروههاي جدید میکربی مدنظر هستند به همراهی روشهاي مولکولی ضروري است 2) و .(29
در زیست محیطهاي آب و خاك ، فاکتور شوري تعیین کننده جمعیتهاي میکربی محسوب می شود. خاکهاي داراي بیش از 0/2 درصد نمک محلول، خاك شور نامیده می شود که در سراسر جهان و به ویژه در مناطق خشک فراوان وجود دارد .(2) اقیانوسها، دریاها، دریاچه هاي شور و مردابهاي نمک از جمله محیطهاي آبی شور شناخته شده اند. دریاچه هاي با میزان نمک بالا ي 0/3 درصد جزء دریاچه هاي شورمحسوب می شود. آبهاي پرشور، تراکم نمک بسیار بالاتري نسبت به آب دریا دارند تنوع موجودات نمک دوست وتحمل کننده نمک در اکوسیستمهاي آبی و خاکهاي شور بسیار گسترده بوده و مجموعه اي از موجودات ماکروسکوپی ومیکروسکوپی را در برمی گیرد 2) و .(22 امروزه مطالعه بر روي میکروارگانیسم هاي نمک دوست به دلیل تواناییهاي ویژه اي که در تحمل شرایط دشوار، تولید انواع متابولیت ها، تجزیه ماکرومولکول هاي گوناگون و پالایش زیستی دارند در جنبه هاي مختلف فیزیولوژي، اکولوژي، ژنتیک و بیوتکنولوژي توسعه یافته است .(5)
از بررسیهاي انجام گرفته بر روي مناطق پرشور ایران می توان به بررسی تنوع زیستی میکروارگانیسمهاي نمک دوست قابل کشت و غیر قابل کشت سواحل غربی در یاچه ارومیه (9) و تولید آنزیمهاي هیدرولیتیک در باکتریهاي نمک دوست این دریاچه اشاره کرد .(7)
همچنین دریاچه فصلی حوض سلطان (6)، دریاچه نمک آران و بیدگل 1)، 2و(5 و دریاچه بختگان واقع در غرب نی ریز (4) نیز از نظر تنوع میکروارگانیسمهاي نمک دوست وتحمل کننده نمک و تولید آنزیمهاي هیدرولیتیک بررسی شده اند.
از مطالعاتی که بر روي تحمل پذیري و مقاومت هالوفیلها نسبت به ترکیبات سمی انجام گرفته می توان به بررسی مقاومت به اکسی آنیونهاي سمی تلوریت ، سلنیت ، سلنات ، ارسنات و کرومات در باسیلوس هاي هالوفیل بومی ایران
(8) بررسی احیاء کروم شش ظرفیتی توسط باکتري هالوفیل نسبی مقاوم به کروم Nesterenkonia sp. strain (10) MF2 و بررسی اثر اکسی آنیونهاي مختلف بر مقاومت به تلوریت در باکتریهاي نمک دوست :
Halomonas elongate، Halomonas maura ، Halobacillus litoralis Virgibacillus salexigenes ، Halobacillus karajensis ، Halobacillus halophillus
، Bacillus halophillus ، Salinococcus iranensis ، Salinivibrio proteolyticus اشاره کرد( .( 8
اهدف اصلی این پژوهش، بررسی یک اکوسیستم پرشور (
تالاب اینچه برون ) از نظر گوناگونی میکروارگانیسم هاي ساکن و درك گوشه اي از تنوع زیستی موجود در آن ، شناسایی توانمندي میکروارگانیسم هاي نمک دوست در تولید متابولیتهاي ثانویه و امکان دستیابی به جنس و گونه هاي جدید براي افزودن به ذخایر ژنتیکی کشور در راستاي در اختیار داشتن یک بانک میکربی غنی و بی نیازي از خرید سویه از بانکهاي میکربی خارج از کشور بوده است.
مکان انجام این پژوهش تالاب پر شور اینچه برون است که در 25 کیلومتري شمال شهر آق قلا ، در فاصله 3
کیلومتري شرق جاده آق قلا – مرز پل در استان گلستان (
N :37.8.57 و ( E: 54.51
واقع گردیده است .این تالاب حدود 100 هکتار مساحت دارد و ارتفاع عمیق ترین نقطه تالاب از سطح دریاي آزاد
۵۴
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
4 متر است و در طبقه بندي کنوانسیون رامسر در گروه نمونه گیري: در اواخر شهریور 1389 از آب، خاك ، لجن
تالابهاي داخلی لب شور و دائمی قرار می گیرد .(3) سطحی وعمقی ، کریستالها ولایه ضخیم نمک، 4 منطقه
مواد وروشها این تالاب نمونه گیري انجام شد. تصویر ماهواره اي تالاب
و نقاط نمونه برداري در شکل 1 نشان داده شده است
(شکل .(1
شکل -1 تصویر ماهواره اي از تالاب اینچه برون و مناطق نمونه برداري
نمونه ها در دماي محیط و در حداقل زمان به آزمایشگاه منتقل شد و pH و شوري آنها اندازهگیري گردید. آنالیز شیمیایی نمک دریاچه جهت سنجش عناصر موجود در محیط زیست طبیعی باکتریهاي این دریاچه و به کار گیري آن در طراحی محیط کشت مناسب که امکان جداسازي طیف گستردهتري از باکتریها را فراهم سازد، توسط شرکت بهین خاك آزما صورت گرفت .
خالص سازي و شناسایی سویه ها: از نمونه هاي منتقل شده به آزمایشگاه براي جدا سازي و کشت باکتریهاي نمک دوست نسبی و تحمل کننده نمک، تا رقت 10-6
سري رقت تهیه شد. براي کشت وخالص سازي از محیط جامد Moderate halophiles(12% salt) شامل(گرم در لیتر): 104 : NaCl، 5/4 : MgCl2.6H2O، MgSO4.7H2O
8/3 :، 0/41 : CaCl2.2H2O، 1/66 : KCl، : NaHCO3 0/08، 5 :Yeast Extract، 1 :Glucose، Peptone from
8 :meat و 15 :Agar براي جداسازي نمک دوستهاي
نسبی ومحیط جامد Seawater Nutrient Agar (3% salt)
شامل(گرم در لیتر): : 20 : NaCl، 3 : MgCl2.6H2 O،
5 : MgSO4.7H2 O، 0/5 : CaCl2.2H2O، 0/5 : KCl، 1 :Yeast Extract، : Peptone from 2 Meat :Extract
5 :meat و 15 :Agar براي جداسازي تحمل کننده هاي نمک استفاده گردید(.(2
افتراق جدایههاي تحمل کننده نمک و نمک دوست
نسبی: باکتریهاي تحمل کننده نمک علاوه بر توانایی رشد در محیط فاقد نمک می توانند غلظتهاي بالاي نمک را نیز تحمل کرده و در این شرایط نیز رشد کنند. به این دلیل که در ترکیب مواد مورد استفاده در تهیه محیط کشت مثل پپتون، عصاره مخمر و عصاره گوشت نمک وجود دارد و این نمک می تواند نیازمندي به نمک را در باکتریهاي نمکدوست پوشش دهد و موجب رشد آنها در محیط فاقد نمک گردد، از محیطی که فقط داراي 5 گرم در لیتر عصاره مخمر بود استفاده شد. این محیط کشت با درصدهاي نمک
0، ./5،3 ، 5، 7/5، 10، 15، 20 تهیه شد، pH محیط با استفاده از سود دو نرمال و HCl یک نرمال در 7/5 تنظیم شد و در دماي 121 درجه سانتی گراد و به مدت 15 دقیقه اتوکلاو گردید. نکتهاي که در افتراق این باکتریها مدنظر قرار گرفت بهینه رشد بود، زیرا تنها توانایی رشد در محیط فاقد نمک براي اینکه یک جدایه را تحمل کننده نمک در نظر گرفت، کافی نیست . براي انتخاب محیط بهینه از نظر درصد نمک، پس ازگذشت 12 ساعت از
۶۴
16S rRNA
پرایمر1488R با ترادف :
Schaeffer-Fulton
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
زمان کشت، هر یک از این محیطها مورد مقایسه قرارگرفت و نمکی بهینه انتخاب شد که اولین رشد پایدار باکتري در آن درصد نمک صورت گرفته باشد 2)و.(5 از 400 جدایه خالص شده ، 55 سویه به صورت تصادفی براي تعیین ترادف ژن 16S rRNA ومطالعات تکمیلی انتخاب گشته و پس از استخراج DNA ، انجام PCR و تعیین ترادف نتایج حاصله با توالیهاي ثبت شده در بانکهاي اطلاعاتی مقایسه گردید.
مطالعات فیلوژنتیک: پس از تهیه تودة زیستی،
استخراج DNA باکتریها، طبق روش دستورزي شده پیشنهاد شده توسط Marmur (1994) انجام گرفت .(20)
جهت تأیید استخراج انجام شده، الکتروفورز ژل آگارز
براساس روش (1997) kolmodin صورت گرفت .(19)
براي تکثیر ژن 16S rRNA از پرایمر هاي عمومی 27F
باترادف:AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG ،
CGG TTA CCT TGT TAC
GAC TTC ACC وپرایمر 1492R با ترادف: GGT TAC
CTT GTT ACG ACT T استفاده شد .(25) به دلیل اینکه تمام سویه ها با یک جفت پرایمر تکثیر نشد دو جفت پرایمر 27F -1492R و 27F-1488R به کار گرفته شد. با استفاده از این پرایمرها ژن 16S rRNA با طول حدود 1500 نوکلئوتید تکثیر شد. براي حصول اطمینان از عدم آلودگی مواد مورد استفاده در PCR شاهد منفی با افزودن آب به جاي DNA الگو در ویال حاوي مخلوط واکنش به کار رفت. دماي اتصال پرایمرها ، مدت زمان اتصال وسنتز براي هر سویه به طور جداگانه بهینه گردید.
تعیین توالی محصول PCR از طریق شرکت ژن فن آوران انجام شد. ترادفهاي به دست آمده با استفاده از نرم افزار
Chromasمرتب شده و با نرم افزار BLAST با توالیهاي ثبت شده موجود در پایگاه اطلاعات ژنومی GenBank و Eztaxon مقایسه شد. به این ترتیب نزدیکترین سویهها
با ترادف ژن مشابه با سویههاي منتخب PCR
شده تعیین شد. آنالیز فیلوژنتیک باکتریهاي منتخب با سویههاي نزدیک به آنها با استفاده از نرم افزار Clustal x
(ویرایش دوم) صورت گرفت. درخت فیلوژنی با استفاده از نرم افزار MEGA (ویرایش پنجم) با الگوریتمهاي Maximum likelihood و Maximum parsimony رسم گردید .(27) بررسی اعتبار شاخههاي درخت با استفاده الگوریتم Bootstrap analysis و با 1000 بار نمونهگیري صورت گرفت .(13)
جدایه هاي منتخب با آزمایشهاي ریخت شناسی و بیوشیمیایی نظیر بررسی شکل کلنی، رنگ آمیزي گرم بر اساس روش (21) Hucker، بررسی شکل میکروسکوپی باکتري، حرکت سلول باکتري به روش لام مرطوب (14)،
رنگ آمیزي اسپور بر اساس روش
(14)، تولید کاتالاز با محلول 3 درصد پراکسید هیدروژن
(16)، تست اکسیداز با استفاده از دیسکهاي آماده (15)
احیاي نیترات و شرایط بهینه رشد از نظر دما ، میزان نمک
و pH بررسی گردیدند. تولید آنزیمهاي هیدرولازي آمیلاز
، پروتئاز ، لیپاز و ژلاتیناز مطابق با دستور ذکر شده در جدول 1 بررسی گردید. بسته به نیاز سویه NaCl به محیطهاي آنزیمی افزوده شد و پس از تلقیح همگی به مدت 2 هفته در دماي 35 درجه سانتی گراد گرما گذاري شدند. (جدول (1
نتایج
جداسازي و شناسایی: با توجه به نتایج حاصل از آنالیز آب، به دلیل بالا بودن میزان یونهاي Na+ و-Cl ، تالاب اینچه برون در گروه مناطق پرشور تالازوهالین با منشاء دریایی قرارمی گیرد.
محل 4 با 5105 cfu باکتري بیشترین بار میکربی را داشت وکمترین تعداد جدایه متعلق به نمونه برداري از منطقه 1
بود . در مجموع 400 جدایه خالص سازي گردید که بیشترین جداسازي از محیط MH با 12 درصد نمک و pH
٧۴
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
5/5 انجام گرفت. با توجه به نتایج ذکر شده در جدول 2، بیشتر جدایه ها باسیلهاي گرم مثبت بودند (جدول .(2
آنزیم
آمیلاز
پروتئاز
لیپاز
ژلاتیناز
شکل -2 نمودار فراوانی و تنوع جنسهاي جدا شده از پژوهش
جدول -1 ترکیب محیطهاي کشت بررسی تولید آنزیم
محیط تولید آنزیم(گرم در لیتر ) روش تشخیص
Beef extract : 3 Soluble starch : 10 , افزودن لوگل ( یدید پتاسیم) بر روي محل رشد
Agar : 15
باکتري و ایجاد هاله شفاف پاسخ مثبت در نظر
پس از آماده سازي pH محیط بر روي 7/5 تنظیم شده و در دماي 115 درجه
گرفته شد.
سانتی گراد براي مدت 10 دقیقه اتوکلاو شد(.(12
Meat extracts : 3 , Peptone : 5 , Skim milk : 20
Agar : 15 وجود هاله شفاف در اطراف کلونیها نشانه
پودر Skim Milk در نیمی از حجم آب محیط حل شده و در دماي 110 درجه
هیدرولیز پروتئین کازئین بوده و به عنوان پاسخ
سانتی گراد به مدت 10 دقیقه اتوکلاو شد و بعد از آن به محیط پایه آگاردار که
مثبت در نظر گرفته شد
پس از آماده سازي بر روي 7/5 pH تنظیم شده در دماي 121 درجه سانتی
گراد، 15 دقیقه اتوکلاو شده است، اضافه شد(.(24
CaCl2.H2O: 0/1 , Peptone :10, Tween 80: 10
15 Agar : ایجاد نواحی رسوب اطراف کلنی ها، به صورت
توئین موجود در این محیط بعد از تهیه در دماي 115 درجه سانتی گراد به مدت دانه هاي سفید همراه با هاله کدر نشان دهنده
20 دقیقه اتوکلاو شد. محیط پایه نیز پس از آماده سازي بر روي 7/5 pH تنظیم تولید آنزیم لیپاز توسط باکتري است.
شده و به صورت جداگانه در دماي121 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه
اتوکلاو شد. دو محیط پس از اتوکلاو به هم اضافه شد(.(23
Meat extracts : 3 , Peptone : 5 , Gelatin : 120 محیطهاي رشد کرده را به همراه یک نمونه منفی
محیط ابتدا آب تا دماي نزدیک جوش گرم شده و نمک و محیط کشت به آرامی
به این ترکیب اضافه شد. pH محیط آماده شده بر روي میزان 7/5 تنظیم شده و در دماي 4 درجه سانتی گراد قرار داده پس از
براي 15 دقیقه در دماي 121 درجه سانتی گراد اتوکلاو شد. محیط آماده شده به 20 دقیقه در صورت مایع بودن محیط نتیجه
روش Stab کشت داده شد. (24) تست مثبت گزارش شد.
٨۴
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
جدول – 2 مختصات مناطق نمونه برداري وتعداد جدایه هاي خالص سازي شده
به تفکیک محل و نتایج لام گرم
منطقه نمونه مختصات جغرافیایی میانگین شوري میانگین pH باسیل گرم باسیل گرم کوکوس گرم جمع
برداري منفی مثبت مثبت
بستر نمکی 17 22 2 41
محل 1 N :37.13.438 E: 26.8 4.2 24 35 6 65
54.30.224
محل 2 N: 37.13.932 E: 28.7 5.2 40 50 5 95
54.30.081
محل 3 N :37.13.829 28.4 5.2 39 37 2 78
E:54.30 .307
محل 4 N: 37.13.517 E: 23.3 6.45 64 50 7 121
54.30.657
جمع کل 184 194 22 400
بررسی فیلوژنی: در 55 سویه ترادف ژن 16S rRNA بدون انجام هیبریداسیون DNA-DNA با گونههاي نزدیک،
مورد بررسی قرار گرفت که با توجه به نتایج در 15 جنس می توانند به عنوان گونههاي جدید مطرح شوند .(26) در
قرار گرفتند. ، از این تعداد جنسهاي Micrococcus و این مطالعه براساس شباهتهاي فنوتیپی در میان سویه هاي
Rhodococcus فقط از محل 1 جدا شده اند .جنسهاي تعیین ترادف شده ، در نهایت 22 سویه نمک دوست نسبی
Kocuria و Dietzia فقط محل 3 و 4 و Desmospora و و33 سویه تحمل کننده نمک جدا گردید که در نمک
Chromohalobacter فقط از محل 4 جدا شدند. تنوع دوستهاي نسبی بیشترین فراوانی متعلق به جنسهاي
وفراوانی جنسهاي جداشده در شکل 2 آورده شده است Marinobacter و Halomonas بود وعمده ترین تحمل
(شکل .(2 کنند ه هاي نمک به جنسهاي Oceanobacillus , Dietzia,
از 55 سویه تعیین ترادف شده ، 13 سویه که متعلق به Bacillus و Kocuria قرابت داشتند .سویه هاي تعیین
ترادف شده از نظر سیستماتیک در 3 ردة 40) درصد
گونه هاي مختلف از 5 جنس , Virgibacillus Bacillus
Firmicutes(، 24) درصد)Actinobacteria و رده 36)
,Dietzia Oceanobacillus و Halomonase بودند ،
درصد)γ-Proteobacteria قرار گرفتند . اغلب سویهها
شباهتی 100 درصد در ترادف 16S rRNA داشتند، که
متعلق به ردة Firmicutes بودند که درختهاي فیلوژنی رسم
آنها را از نظر ارائه به بانک میکربی به عنوان
شده به روشMaximum likelihood براي هر رده و
میکروارگانیسم بومی شناسایی شده حائز اهمیت می سازد.
محل قرار گرفتن سویه هاي بررسی شده در آن، در
همچنین در 13 سویه که متعلق به 3 جنس Bacillus,
شکلهاي3، 4 و5 نشان داده شده است (شکلهاي3، 4 و.(5
