بخشی از مقاله
خلاصه:
گلوتاتیون S ترانسفراز - GST - یک آنزیم چند عملکردی است که تصور می شود در شروع فرایند سم زدایی از ترکیبات فعال دارویی نقش فیزیولوژیکی دارد. این آنزیم واکنش میان ترکیبات گزنوبیوتیک و گروه S-H را کاتالیز می کنند. این واکنش اتصالی منجر به کاهش فعالیت بیولوژیکی و افزایش حلالیت ترکیب می شود؛ به گونه ای که ترکیبات حاصل به صورت متصل به گروه تیول، قطبی تر هستند و در نتیجه حذف آنها راحت تر است. فعالیت این آنزیم در گروه بزرگی از گونههای بیمهره بررسی شده است که نشان دهنده وجود ارتباط بین فعالیت آنزیم GST و تحمل این ارگانیسمها نسبت به ترکیبات خارجی است. گاماروس از جمله بی مهرگانی است که به طیف گسترده ای از آلاینده ها حساس هستند و برای تشخیص آلاینده های محیطی مناسب می باشند، به همین دلیل معمولا به عنوان ارگانیسم مدل در مطالعات آلودگی های محیط زیست استفاده می شوند.
خالصسازی نسبی آنزیم GST هدف اصلی این مطالعه بوده است. به منظور کاهش حجم،افزایش غلظت و خالص سازی پروتئینها روشهای رسوبگذاری مختلفی میتواند مورد استفاده قرار گیرد. با غلظتهای مناسب از نمک آمونیوم سولفات،پروتئینها با حلالیت مختلف از یکدیگر جدا میشوند. در مطالعه ما نمک آمونیوم سولفات با غلظت نهایی %60 و %90 به هموژن گاماروس افزوده شد. محلول حاصل با دور 12000xg سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی - supernatant - در 4 درجه سانتیگراد در بافر فسفات - 100mM,PH=7 - حاوی 0/15 میلیمولار نمک NaCl به مدت یک شب دیالیز شد. غلظت پروتئین به روش برادفورد اندازه گیری و فعالیت آنزیم GST به روش Habig سنجیده شد. مقدار پروتئین در غلظت %60 و %90 کاهش یافت؛ فعالیت آنزیم در %90 کاهش 3 درصدی داشت اما در مقایسه با آن، در محلول اشباع %60 یک افزایش 4 برابری در میزان فعالیت آنزیم مشاهده شد.
در نتیجه، یافته های موجود رسوب با آمونیوم سولفات را به عنوان یک روش برای تغلیظ و تخلیص آنزیم پیشنهاد میکند.
واژگان کلیدی: گاماروس، گلوتاتیون S ترانسفراز، رسوب با آمونیوم سولفات، خالص سازی
.1 مقدمه:
موجودات زنده، به منظور محافظت از ماکرومولکول های مهم در برابر آسیب های حاصل از گزنوبیوتیک هایی که از طریق هوای آلوده، آب یا حتی مواد غذایی وارد سلولها میشوند، سیستم هایی برای سم زدایی ایجاد کرده انداز جمله سیستم های سم زدایی می توان به خانواده ای از آنزیم هایی اشاره کرد که به طور اختصاصی به همین منظور طراحی شده اند و قادرند مولکولهای سمی را با هدف دفع از سلول به محصولات بی ضرر تبدیل کنند و یا توسط برخی از مسیرهای متابولیک مورد استفاده مجدد قرار گیرند. این آنزیمها، آنزیمهای سمزدا نام دارند - Hamed, Ramadan, Aziz, & - Maharem مانند آنزیم گلوتاتیون S ترانسفراز. آنزیم گلوتاتیون S ترانسفراز - GST,EC:2.5.1.18 - افزودن گروه تیول از گلوتاتیون احیاء شده به طیف وسیعی از ترکیبات را کاتالیز میکند - Hong, Park, & Kong, 1999 - که منجر به افزایش قطبیت و در نتیجه دفع آسانتر آنها میشود - Abdalla, El-Mogy, Farid, & El-Sharabasy, 2006 - و با توجه به اهمیت سمزدایی با واسطه گروه تیول در داروهای ضد سرطان، گلوتاتیون و گلوتاتیون اس ترانسفراز در تعیین ویژگیهای سلولهای مقاوم به دارو اهمیت زیادی دارند و بهطور خلاصه میتوان گفت کهGST ها ازجمله عوامل مهم در پاسخ دارویی برخی از داروهای ضد سرطان هستند. - Tew, 1994 -
این آنزیم بهصورت گسترده از پستانداران و همچنین گروه بزرگی از گونههای بی مهره استخراج شده و ساختار و عملکرد آن بهصورت دقیق مورد بررسی قرارگرفته است. - Hong, Park, & Kong, 1999 - این بررسی ها در جانداران بیمهره نشانگر وجود رابطه میان میزان فعالیت آنزیم GST و قدرت تحمل این ارگانیسمها به سموم خارجی در آنها بوده است. برخی از این گونههای بی مهره مانند گاماروس ها به دلیل توانایی تحمل مسمویت های محیطی و همچنین حساسیت بالا نسبت به طیف گسترده ای از الایندهها بهعنوان ارگانیسم مدل در شناسایی مسمومیت های محیطی مورد توجه قرارگرفتهاند. - Aceto et al., - 1991، - Kutlu & Susuz , 2004 - جنس گاماروس در دو گونه مختلف دریایی و آب شیرین تقسیمبندی میشوند. - Karaman, 1977 -
بررسی GST در جاندارانی مانند گاماروس به ما کمک میکند که به درک بهتری از پروتئینهای مرتبط به GST و همچنین سیر تکاملی آنزیم برسیم. به منظور انجام مطالعات بر روی آنزیم در ابتدا باید آنزیم مورد نظر را به صورت خالص از سایر پروتئین ها جدا کنیم، اما جداسازی آنزیم ها در یک ترکیب پروتئینی همواره یک چالش بزرگ برای بیوشیمیست ها بوده است. - Polson, - 1964 با توجه به اینکه آنزیم ها مولکول هایی محلول در آب هستند ، می توان آنها را با افزودن یک ترکیب خاص مانند نمک آمونیوم سولفات و ایجاد تغییر در میزان حلالیتشان از یکدیگر جدا کرد. این فرایند رسوب دهی - precipitation - نام دارد و به صورت گسترده به عنوان روشی برای جداسازی ترکیبات زیستی به کار برده می شود. - - Foster, 1973
