بخشی از مقاله
چکیده
لیپازها گروهی از آنزیمها هیدرولازی میباشند که با هیدرولیز باندهای استری تری گلیسریدهای زنجیره بلند باعث تجزیه انها به گلیسرول واسید چرب میگردند. در سال های اخیر استفاده از انزیم های میکروبی مانند لیپاز در صنایع شوینده بسیار مورد توجه قرار گرفت است. انزیم لیپاز علاوه بر افزایش قدرت پاک کنندگی، دارای فواید زیست محیطی با کاهش مصرف انرژی با زمان شستشوی کوتاهتر،کاهش دمای شستشو و کاهش میزان مصرف آب می باشند و همچنین منجر به کاهش pH آب شستشو و مراقبت های ویژه از پارچه می شود.
بکارگیری انزیم لیپاز در فرمول شوینده ملزم به داشتن فاکتورهایی شامل داشتن پایداری و فعالیت در دماهای 60 -30œC ، در pH قلیایی 9 -12 در حضور بازدارنده ها یا غیر فعال کننده ها می باشند. هدف از این پزوهش خالص سازی نسبی انزیم لیپاز حاصل از سویه 101MZV Ochrobactrum intermedium جهت بکارگیری در صنایع شوینده می باشد. اپتیمم انزیم لیپاز سویه 101MZV pH = 9، دمای 60 œC می باشد.
استفاده از انزیم لیپاز در صنایع شوینده نیاز به کسب میزان خلوص بالا انزیم نیست. برای رسوب دهی انزیم لیپاز از روش رسوب دهی با استفاده از آمونیوم سولفات و در ادامه دیالیز جهت نمک زدایی و روش کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون برای جداسازی نسبی آنزیم موردنظر استفاده شد. میزان فعالیت انزیم لیپاز تخلیص شده با استفاده از پارانیتروفنیل پالمیتات به عنوان سوبسترا و میزان پروتئین این انزیم با استفاده از روش لوری، در مراحل مختلف تخلیص اندازه گیری شد. نتایج حاصل از خالص سازی، میزان از ، فعالیت ویژه انزیمی 3.261 - U/mg - به فعالیت ویژه انزیمی 62.270 - U/mg - ، درصد بازده 48.452 و تخلیص 19.095 بود. وزن مولکولی انزیم لیپاز حاصل از سویه101MZV با استفاده از روش الکتروفورز بر ژل - ~99.42kDa - SDS-PAGE تخمین زده شد.
مقدمه و هدف
لیپازها یا تری اسیل گلیسرول هیدرولازها - EC 3.1.1.3 - واکنش های هیدرولیزی و سنتزی را کاتالیز می کنند که در واکنش هیدرولیز تری اسیل گلیسرول را به گلیسرول و اسید چرب می شکنند. سوبستراهای طبیعی لیپاز ها، تری آسیل گلیسرول های دارای اسید های چرب بلند زنجیره - & 8 - هستند و از این رو حلالیت کمی در آب دارند .[10] مهمترین میکروارگانیسم های متدوال مورد استفاده در صنعت Archromobacter, Arthrobacter and Alcaligenes, Bacillus, Burkholderia, Chromobacterium, pseudomonas هستندو جنس Pseudomonas رایج ترین نوع در صنعت تولید انزیم لیپاز می باشد.[22]
لیپازها یکی از پرکاربردترین انزیمها در زمینه های متنوع زیست فناوری هستند که از این جمله میتوان به کاربرد ان در ترکیبات شوینده، صنعتی و مصارفه خانگی نیز اشاره نمود .[2] خصوصیاتی مثل فعالیت و پایداری در دمای و pH بالا، توانایی پایداری در حلالهای آلی و هزینههای نسبتا پایین و در سهولت در تولید لیپاز های میکروبی، انها را به یکی از مهمترین انواع انزیم در صنعت تبدیل کرده است .[4]
روش های مورد استفاده در خالص سازی بطور کلی غیر اختصاصی همچون تکنیک های رسوب دهی، کروماتوگرافی هیدروفوبیک ، ژل فیلتریشن و کروماتوگرافی تعویض یونی می باشد .[6] به هدف استفاده انزیم لیپاز در صنایع شوینده نیاز به کسب میزان خلوص بالا انزیم نیست. عمدتا خالص سازی نسبی یا از ماده خام حاصل استفاده می شود. استفاده از نمک امونیوم در این صنایع بسبب ارزان بودن، حلالیت بالا در اب و عدم تخریب ساختار پروتئینی انزیم بر روش های دیگر ارجحیت دارد .[3]
هدف از دیالیز محلول پروتئینی، خالص سازی ان و به حذف نمک آمونیوم سولفات می باشد. مکانیسم دیالیز بدین گونه است که اختلاف فشار اسمزی درون و بیرون تیوپ باعث بیرون رانده شدن ملکول های کوچک به خارج تیوپ و باقی ماندن سایر محتویات درون ان می باشد .[15,16] انتخاب بافر مناسب نقش بسیار مهمی در پایداری pH در در دمای اتاق، حفظ ساختار پروتئینی، پایداری فعالیت انزیم دارد. به بهمین دلیل باعث غیر فعال یا تغییر در ساختمان پروتئینی نمی شود روش کروماتوگرافی معمول انزیم لیپاز در صنایع شوینده، کروماتوگرافی تعویض یونی و کروماتوگرافی ژل فیلتریشن می باشد.
در اغلب موارد استفاده از یک مرحله ستون کروماتوگرافی جهت خالص سازی کافی نیست و نیازمند استفاده ترکیبی از کروماتوگرافی های مختلف می باشد. فیاتراسیون ژلی در خالص سازی از نظر کاربرد در 60% برای خالص سازی مورد استفاده قرار می گیرد .[13] در این تحقیق جهت خالص سازی انزیم حاصل از 101MZV به روش کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون با استفاده از ستون Sephadex G-50 که اساس این ستون اساس وزن ملوکولی از کوچکتر به بزرگتر صورت گرفت .[8] در این پژوهش خالص سازی نسبی انزیم لیپاز حاصل از سویه Ochrobactrum intermedium 101MZV به هدف استفاده ان در در صنایع شوینده صورت گرفت.
تئوری و پیشینه تحقیق
احتمال حفظ فعالیت انزیم لیپاز حاصل از سویه مورد نظر در تمامی مراحل خالص سازی برای استفاده در شوینده ها بسیار زیاد می باشد.
مواد و روشها مواد مورد استفاده
پرایمرهای 20F و 1492R از شرکت پیشگام، پارانیتروفنول پالمیتات از Titrachem ، Rhodamin B و مابقی مواد و محیطهای مورد استفاده در این پژوهش از شرکت Merck تهیه شدند.
باکتری مورد استفاده
Ochrobactrum intermedium 101MZV باکتری قلیا-گرما دوست تولید کننده انزیم لیپاز برون سلولی از چشمه قینرجه نیر از 6 کیلومتری جنوب غربی شهرستان نیر با دمای 60œC و pH=8.6 با هدف بکاگیری در صنایع شوینده در اینده بود، جداسازی، انتخاب و شناسایی گردید.
محیط کشت مایع پایه
این محیط جهت تلقیح اولیه که شامل 1g پپتون، 0.5 g عصاره مخمر، 1g کلرید سدیم ، % 1 روغن زیتون بعنوان تنها منبع انرژی و کربن و ml 100 اب مقطر در ارلن 250ml ریخته شد. محیط کشت مورد نظر در دمای 60 œC، pH=11 و دور شیکر rpm=180 به مدت 72 ساعت قرارداده شد. سپس با دور 13300 × g بمدت 10 دقیقه در دمای 4 œC سانتریفویژ شد.
روش سنجش انزیمی به طریق اسپکتروفوتومتری
جهت اماده سازی محلول سنجش فعالیت انزیمی، Para-nitrophenyl palmitate 30 mg را در ml 10 ایزوپروپانول حل کرده و به ان را به 90 ml از - pH= 8 - فسفات بافر 0.05 M و 207 mg سدیم داکسی کولات اضافه شد . برای تهیه سوپرناتانت سلولی 1.5 ml از محیط کشت را با دور 13300 × g بمدت 10 min سانتریفیوژ شد. سپس 0.1 ml از سوپرناتانت را به 2.4 ml از محلول فوق اضافه و بمدت 15 دقیقه در دمای 37 F انکوبه شد و پس از ان میزان جذب نوری در طول موج 410 nm خوانده شد. محلول تهیه شده فوق بهمراه 0.1 ml اب مقطر بعنوان شاهد در نظر گرفته شد.[1,20]
پروتئین سنجی
از روش Lowry و همکاران درسال 1951 برای سنجش پروتئین محلول استفاده شد، به این ترتیب که از آلبومین سرم گاوی با غلظت 1 میلی گرم در میلی لیتر به منزله استاندارد استفاده و قرائت نوری در 750 نانومتر انجام شد .[12] در تمامی مراحل خالص سازی محلول پروتئینی از نظر فعالیت انزیمی، سنجش پروتئین اندازه گیری شد و فعالیت ویژه انزیمی ، بازده و تخلیص مورد محاسبه قرار گرفت.
بررسی تاثیر دما و pH بر پایداری و فعالیت انزیم حاصل از سویه 101MZV
بمنظور بررسی تاثیر دما بر فعالیت و پایداری انزیم دماهای10-90 درجه ی سانتیگراد و pH 6 -11 انتخاب شد. میزان فعالیت انزیم لیپاز سویه 101MZV بمدت 30 و برای پایداری انزیم 2 ساعت در pH و دماهای متفاوت انکوباسیون و اندازه گیری گردید.
رسوب دهی و دیالیز انزیم لیپاز
در مرحله رسوب دهی، بمنظور تعیین نمک مورد نیاز جهت رسوب دهی پروتئین های محلول، از درصدهای مختلف 30%-80% انتخاب و با افزودن تدریجی امونیوم سولفات به صورت سوپرناتانت حاصله در دمای 4œC صورت گرفت . محلول اشباع حاصل در دمای 4œC و سپس با دور 13300 × g بمدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد.
