بخشی از مقاله
جدا سازي و خالص سازي ايزو آنزيم هاي پراکسيداز از تربچه
مقدمه
آنزيم پراکسيدازازمهمترين آنزيمهاي خانواده اکسيدو ردوکتازها بوده و با 1.11.1.7:EC مشخص مي شود از هموپروتئينهاي گليکو پروتئيني است که گروه پروستتيکآن حاوي پروتوپورفيرين Fe IXاست (١).
درساختاراين آنزيم اتم کلسيم ديده شده که براي شکل گرفتن ساختار سوم پروتئين ضروري است (٢).
وجودده مار پيچ آلفا و چهار بانددي سولفيدي نيز درساختمان آنزيم به اثبات رسيده است (٣).
اين آنزيم داراي ايزو آنزيمهاي کاتيوني و آنيوني متفاوتي مي باشد (٤) و به اشکال مختلف کلرو پراکسيداز ، لاکتوپراکسيداز ، فلاوپراکسيداز ، ميلوپراکسيداز و تيروپراکسيداز و پروستاگلندين هيدروپراکسيداز و نيز پراکسيداز هاي گياهي در منابع مختلف وجود دارد که اعمالي را در رابطه با برداشت H2O2 که يک ماده سمي براي سلول است ، انجام مي دهد.
اين آنزيم کاربردهاي فراواني را در زمينه هاي تشخيص آزمايشگاهي به روش ايمونواسي درتکنيک ELISA جهت اندازه گيري هورمونها از جمله تيروکسين ، انسولين ، HCG ، استروژن ،پروژسترون و سم باکتريها دارد علاوه بر آن در تشخيص آنتي ژنهاي بافتي و فعال کردن ماکروفاژها در برابر تومورهاي سرطاني درانواع روش هاي پاتولوژي و هماتولوژي وايمونولوژي به کاربرده مي شود(٥و٦).
در ضمن جهت تعيين ميزان گلوکز در سرم و ادرار و کلسترولو اوره و اسيداوريک با استفاده از کيتهاي آنزيمي نيز مورد استفاده قرار مي گيرد(٧).
با در نظر گرفتن کاربرد وسيع آنزيم و فراواني آن در منابع گياهي قابل دسترس در ايران ، اين طرح جهت استخراج و جدا سازي ايزو آنزيم هاي مختلف مدنظر قرارگرفت .لازم به تذکراست که هنوز آنزيم مصرفي براي کاربرد هاي مختلف با صرف هزينه هاي دلاري فراوان واردکشورمي شوددرحاليکه کشورهاي توليدکننده آنزيم را از منابع گياهي قابل دسترس در هر منطقه استخراج مي کنند.
مواد و روش ها
ابتدا مقدار ٥٠٠گر م از Cultivated Radish با بافر فسفات پتاسيم ٠.١ مولارو ٧.٢گPH هموژنيزه شد. تغليظ عصاره خام حاصله در دو مرحله با سولفات آمونيم (مرحله اول ٣٥-٠%) و مرحله دوم (٩٠-٣٥%) در دستگاه سانتريفوژ يخچال دار Damonice B-20A Division (0-2000RPM)
انجام گرفت (٨). رسوب حاصله از مرحله دوم تغليظ به منظورجداسازي نمکهاوتنظيم PH در مقابل بافرتريس ٠.٠٠٥ مولار٨.٢ = PH در٤ درجه سانتيگراد دياليز شد (کيسه دياليز Sigma .(cut off = 12 KD
مقدارپروتئين موجود در نمونه ها به روش براد فورد (٩) و فعاليت آنزيم به روش پيروگالل (١٠) تعيين شد. به منظور تعيين درجه خلوص اين هموپروتئين از شاخص Rz استفاده شد که مقدار آن عبارت است از نسبت ميزان جذب نوري در طول موج ٤٠٣ نانومتر به ميزان جذب نوري در طول موج ٢٧٥ نانومتر. کليه اين پارامتر ها توسط دستگاه اسپکتروفتومتر–640-BECKMAN Du UV-VISIBLE اندازه گيري شد .
سپس نمونه جهت کروماتوگرافي ژل فيلتراسيون روي ستون 100-sephadex G در مقابل بافر فسفات ٠.٠٢ مولار و ٧.٢ = PH دياليزشده وپس از انتقال به ستون و شستشوي آن با بافر، ميزان جذب نوري در ٢٨٠نانومتروفعاليت آنزيم اندازه گيري شده و محتواي لوله هاي داراي فعاليت پراکسيدازي بالا با يکديگر ادغام وRz، ميزان پروتئين و فعاليت آنزيم درآنهااندازه گيري شد.درمرحله بعدجهت انتقال به ستون CM-Cellulose درمقابل بافراستات ٠.٠٠٥ مولار و٤.٤ = PH دياليزشدو به ستون منتقل و با استفاده ازگراديان خطي بافرشستشو داده شدچنانچه درنمودار شماره ١ ملاحظه مي شود لوله هاي داراي فعاليت پراکسيدازي بالا(پيکI) با يکديگر ادغام شده و سنجشهاي لازم در آن صورت گرفت (١١).
سپس جهت انجام کرو ماتوگرافي روي -DEAE Cellulose در مقابل پروتئين و فعاليت آنزيم در آنها اندازه گيري شد. در مرحله بعد جهت انتقال به ستون CM- Celluloseدرمقابل بافراستا ت ٠.٠٠٥ مولارو٨.٤ = PH دياليزشد و به ستون منتقل وبا استفاده ازگراديان خطي بافرشستشوداده شد،چنانچه درنمودارشماره ١ ملاحظه مي شود لوله هاي داراي فعاليت پراکسيدازي بالا (پيک ١) با يکديگر ادغام شده و سنجشهاي لازم در آن صورت گرفت .
سپس جهت انجام کروماتوگرافي روي -DEAE Cellulose در مقابل با فرتريس ٠.٠٠٥ مولار و ٨.٤ = PH دياليزانجام گرفت وپس ازانتقالنمونه به ستون بابافرتريس شامل گراديان خطي ازنمکشستشو داده شد و پارامترهاي مربوطه درآنها اندازه گيري شد.
لوله هاي داراي فعاليت پراکسيدازي (پيکIIوپيکIIIدرنمودار شماره ١) هر کدام به ستون -CM Cellulose دوم منتقل شده و با گراديان خطي بافر شستشوداده شد تا شاخص هاي مذکور در آنها اندازه گيري شود(١٢). نهايتا نمونه هاي کنار گذاشته از هر مرحله همراه با مارکر هاي وزن مولکولي SDS- PAGE شده و وزن مولکولي ايزو آنزيمها محاسبه شد.
نتايج
ايزوآنزيمهاي بدست آمده (نمودار١) فعاليت ويژه و RZ قابل مقايسه با انواع تجاري آنزيم پراکسيداز دارند(جدول ١). درجه خلوص ايزوآنزيم I بار، ايزوآنزيم II بار و ايزوآنزيم III بار افزايش نشان مي دهد (جدول٢). وزن مولکولي ايزوآنزيم ها در مقايسه با مارکرهاي وزن مولکولي (عکس ١) بدست آمد ايزوآنزيمI ٤٢ کيلو دالتون و ايزو آنزيم II وIII ٥٨ کيلو دالتون .
جدول شماره ١: مقايسه فعاليت ويژه و RZ ايزوآنزيمهاي خالص شده با نمونه هاي تجاري
نمودار شماره ١: کروماتوگرافي روي ستون CM سلولز نمونه حاصل شده از ستون سفادکس ١٠٠-G
عکس شماره ١: ١- نمونه جمع آوري شده ازCM سلولز(پيک I,II,III) ٢- پيک شماره I ٣-پيک شماره II
٤-پيک شماره III ٥- مارکر هاي وزن مولکولي ( ٩٧-٦٥-٤٥-٣٠ کيلو دالتون )
بحث و نتيجه گيري
در اين مطالعه تغليظ عصاره خام با استفاده از پودر سولفات آمونيم در دو مرحله صورت گرفت .
