بخشی از مقاله
مقدمه :
در مراکز تحقیقاتی دنیا مطالعات زیادی برروی عناصـر کمیاب (trace element) و نقش متابولیسمی آنهـا در بـدن در حال انجام می باشد . عناصر کمیاب اگر چـه بـه مقـدار جزئی در ساختمان پروتئین ها و آنزیم هـای مختلـف بـدن وجود دارند ولی افزایش سطح سرمی این عناصر مـی توانـد موجب بروز اختلالات متعدد شـــــــده و بعضا" در اعمال
یکدیگر تداخل می نمایند .
منگنز (Mn) یکی از این عناصر می باشـد کـه از یـک طرف به عنوان یک عنصر کمیاب و از طرف دیگر به عنـوان یک عنصر سمی اثرات خود را در واکنشهای مختلف در بدن انجــام مــی دهــد(١). ایــن عنصــر در ســاختمان برخــی از متالوآنزیمهـــا شـــامل منگنـــز سوپراکســـید دســـموتاز
(MN-SOD) و گلیکوزیل ترانسفراز شرکت می نماید(٣،٢)
ـــــــــــــــــــــــــــــــــ
* عضو هیأت علمی گروه بیوشیمی و تغذیه دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی همدان
SDS-PAGE
چنین تأئید فعالیت سرولوپلاسمین تخلیص شده ، از این تکنیک استفاده گردید(١٣). ترانسفرین از کارخانه sigma
تهیه و پس از عمل دیالیز به صورت خالص درآمد(١٤).
عمل دیالیز با استفاده از محلولهای بافر استات (٥٠ میلی مولار و ٢/٥(pH= و کلرید سدیم (١٥/٠ میلی مولار) ، بیکربنات سدیـــــم (٠٢/٠ مولار) در محلول کلرید سدیم (١٥/٠ مولار ) و نهایتا" بافر تریس ـ هیدروکلراید ـ بیکربنات (١٠٠ میلی مولار و ٤/٧(pH=
انجـــــام شد(١٥،١٤). با استفـــــاده از محلـــــول آپوترانسفرین خالص mg/ml)٥) که در بافر تریس ـ هیدروکلراید ـ بیکربنات با ٤/٧pH= تهیه شده طیف جذبی آپوترانسفرین و ترانسفرین اشباع شده با منگنز بررسی و ماکزیمم طول موج (λmax) کمپلکس منگنز ـ ترانسفرین بوسیله دستگاه اسپکتروفتومتریک از نوع
Perkin-Elmer 5515 uv/vis Recorder 561 تعیین گردید .
٢- تکنیک کروماتوگرافی میل ترکیبی :
سال دهم ، شماره٢ ، تابستان ١٣٨٢ ، شماره مسلسل ٢٨ ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ ٣٧
و فعالیت آنزیم ٥- آمینولوولینات سنتتاز را در نواحی مختلفی از مغز رات بویژه در مخچه ، مغز میانی و قشر مغز مهار می کند (٤).
کمبود منگنز در انسان بندرت مشاهده می شود در حالی که مسمومیت با این عنصر در موارد متعددی گزارش شده است (٥).مسمومیت با منگنز در افرادی که در معرض غلظتهای بالائی از این عنصر یا ترکیبات آن قرار دارند (کارگران کارخانه های باطری خشک)
مشاهده می شود و در دوران نوزادی از اهمیت ویژه ای برخوردار است (٦،٥). تحقیقات نشان میدهد مسمومیت با منگنز تشکیل هموگلوبین را کاهش داده باعث ظهور کم خونی میشود. اثرات سمی این عنصر همچنین در موارد مختلف از جمله در cerebellar damage: و neuronal degeneration وganglionic disorder و
پارکینسون مورد توجه قرار گرفته است (٧). منگنز پس از جذب از روده ها به جریان خون وارد شده و توسط پروتئین های مختلف خصوصا" ترانسفرین به سلولهای هدف می رود . ترانسفرین یک بتا - گلوبولین با وزن ملکولی٨٠ کیلو دالتون است (٨). تعداد زیادی از یونهای فلزی از قبیل آلومینیوم (٨)، کروم (٩) و روی (١٠)
می توانند با اتصال به ترانسفرین متابولیسم آهن را مختل نمایند. پیش از این با بکار بردن تکنیکهای مختلــــف بیـــوشیمیائـــــی شامل western blot و fast protein liquid chromatography و همچنین
اتصال منگنز به ترانسفرین سرم انسان
تائید شده است (١١). اتصال این عنصر به ترانسفرین
می تواند در متابولیسم آهن اختلال ایجاد نماید (١٢).
سایر مطالعات انجام شده با روشهای متفاوت و صرفا" با استفاده از حیوانات آزمایشگاهی انجام شده است. حتی با مطالعاتی که تا امروز نیز انجام شده ، پروتئینهای ناقل منگنز در سرم انسان به طور قطع و یقین مشخص نشده است و محققان سه پروتئین Transferrin
، Transmanganin و Albumin را معرفی کرده اند. لذا هدف از انجام این پژوهش ، بررسی و تعیین نقش تداخلی منگنز در یکی از مراحل متابولیسم آهن (یعنی انتقال پلاسمایی آن) می باشد.
روش کار:
١- تکنیک اسپکتروفتومتریک: برای مطالعه و مقایسه اتصال Mn2+ وMn3+ به ترانسفرین موجود در سرم و هـم
سرولوپلاسمین
سرم انسان با استفاده از تکنیک کروماتوگرافی میل ترکیبی (affinity chromatography) استخراج گردید
(١٨-١٦). ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی که در این پروﮊه تهیه شد، ستون سفارز حاوی آنتی سرولوپلاسمین می باشد. آنتی سروپلاسمین از کارخانه سیگما خریداری گردید. جهت انجام این قسمت از پروﮊه مقدار یک میلی لیتر از سرم انسانی که حاوی سرولوپلاسمین است را در دو میلی لیتر بافر فسفات ١/٠ مولار با ٢/٧pH= رقیق کرده و روی ستون اضافه می شود . ابتدا از بافر فسفات با٢/٧pH= و سپس جهت جدا شدن سرولوپلاسمین از آنتی سرولوپلاسمین متصل شده به سفارز از بافر فسفات سیترات با ٨/٢pH= استفاده گردیده. پس از خروج پروتئین های اضافی و سرولوپلاسمین تمام لوله ها در طول موج ٢٨٠ نانومتر قرائت گردید و منحنی مربوطه رسم شد .
٣- تکنیک دیالیز تعادلی : اتصال منگنز و آهن به ترانسفرین موجود در سرم انسان بوسیله تکنیک دیالیز تعادلی نیز مورد بررسی قرار گرفت (١١). با این روش می توان ثابت اتصال هر مولکول به لیگاند اختصاصی آن را محاسبه نمود که از نظر بالینی فوق العاده با ارزش خواهد بود. اساس این تکنیک عبور مولکولهــایی با وزن مولکولی کم از غشاﺀ نیمه تراوا به طرف ماکرومولکـــول
مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی همدان ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ ٣٨
می باشد. دستگاه دیالیز شامل یک دسیکاتور معمولی با درب شیشه ای سوراخ دار می باشد. سوراخها جهت ورود جریان گاز ، نمونه برداری و یا افزودن مواد به داخل کیسه دیالیز می باشند. در داخل دسیکاتور یک ظرف پلاستیکی در باز قرار دارد که از بافر تریس ـ هیدروکلراید ـ بیکربنات ٠٠٥/٠ مولار با ٤/٧pH= پر شده است و کیسه دیالیز درون این بافر معلق خواهد شد. از pH خارج کیسه دیالیز در طول آزمایش بوسیله جریان گازی شامل ٩٥درصد اکسیژن و٥ درصد دی اکسید کربن ثابت نگه داشته می شود . با استفاده از اطلاعات بدست آمده از این تکنیک، منحنی scatchard
را رسم نموده ثابت اتصال ka) )منگنز به آپوترانسفرین را محاسبه می کنیم .
٤- تکنیک الکتروفورز: تغییرات الگوی الکتروفورتیکی آپوترانسفرین متعاقب متصل شدن Mn2+,Mn3+ به آن ، به وسیله تکنیک الکتروفورز((electrophoresis بررسی و مقایسه شد. برای انجام این مرحله از آزمایشها ابتدا یک محلول mg/ml٥ از آپوترانسفرین در بافر تریس ـ هیدروکلراید ـ بیکربنات تهیه گردید . تعدادی لوله دآیونیزه شده انتخاب و به تمامی آنها ٥/٠ میلی لیتر از محلول آپوترانسفرین فوق اضافه گردید. در لوله های فوق به طور جداگانه غلظتهای مختلفی از Mn3+,Mn2+
(در حضور سرولوپلاسمین و یا در حضور اتانول آمین) را فراهم کرده ، به مدت لازم در محیط آزمایشگاه انکوبه شدند. سرولوپلاسمین یا اتانول آمین در این مرحله به عنوان اکسید کننده عمل می کنند. پس از انکوباسیون ، با روش urea-polyacryl amide gel electrophpresis
نمونه های مذکور را الکتروفورز کرده و تغییرات الگوی الکترفورتیکی آپوترانسفرین متعاقب اتصالش با
Mn2+,Mn3+ بررسی گردید. در این مرحله الکتروفورز به طریق continous انجام شد (١٤).
نتایج :
در این تحقیقات ابتدا طیف جذبـــــی (λ max)
ترانسفرین، کمپلکس آهن ـ ترانسفرین و کمپلکس منگنز ـ ترانسفرین تهیه گردید که پس از مقایسه این طیف ها ماکزیمم جذب کمپلکس آهن- ترانسفرین در طول موج ٤٦٥ نانومتر و کمپلکس منگنز ـ ترانسفرین در طول موجهای ٤١٠ و ٣٤٠ نانومتر تعیین گردید. اثرات منگنز بر اتصــــال آهن به ترانسفرین سرم انسان نیز مــــورد
مطالعه قرار گرفت. افزودن منگنز(g/ml ٥/١) به مخلوط واکنش شامــــل آهن و ترانسفرین ، اتصـــــال Fe به ترانسفرین را به میزان٢٠ درصد ، در مقایسه با کنترل ، کاهش داده است. اتصال منگنز به آپوترانسفرین بوسیله تکنیک دیالیز تعادلی نیز تأیید گردید (نمودار ١).
160
140 ml)
120 (ug/100
100
80
bound
60
40 Mn
20
0
900 1000 1100 800 700 600 400 500 300 200 0 100
Mn added (ug)
نمودار ١: برداشت منگنز توسط آپوترانسفرین با
استفاده از دیالیز تعادلی
با استفاده از نمودار scatchard و اطلاعات نمودار١، ثابت اتصال((ka منگنز به آپوترانسفرین تقریبا"١M- ١٠٩ ١/٣
محاسبه گردید (نمودار ٢).
3
2.5
2 Bound/free
1.5
1
0.5
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180
Mn bound (ug/100 ml)
نمودار ٢: منحنی scatchard plot باند شدن منگنز به آپوترانسفرین و محاسبه ثابت اتصال
در مطالعاتی که پیش از این انجام شده احتمال بهتر باند شدن منگنز III به ترانسفرین به صورت یک فرضیه گزارش شده است (١). بدین منظور (تهیه ( Mn3+ ، در این پروﮊه سرولوپلاسمین به عنوان یک عامل اکسید کننده بوسیله تکنیک کروماتوگرافی میل ترکیبی تخلیص گردید . ابتدا طیف جذبی ( λ max ) کمپلکس
Mn3+ ترانسفرین تهیه و با طیف جذبی((λ maxکمپلکس
Mn2+ ترانسفرین مقایسه شد. نتایج نشان دهنده این است که طیف جذبی این دو کمپلکس مشابه یکدیگـــر
