بخشی از مقاله
چکیده:
افدرین یک ماده مهم مورد استفاده در صنایع دارویی با خواصی مانند ضداحتقان، ضدحساسیت میباشد.افدرین به روشهاي مختلفی مانند استخراج از گیاه و سنتز شیمیایی و میکروبی تولید می گردد. تولید میکروبی افدرین جایگزین مناسبی براي استخراج این ترکیب از گیاه و سنتز شیمیایی میباشد. در این روش ابتدا ترکیب -Lفنیل استیل کاربینول - L-PAC - به روش میکروبی تولید شده و سپس این ترکیب به روش سنتزي به افدرین تبدیل میشود.
در این پژوهش تولید میکروبی L-PAC با استفاده از مخمر Saccharomyces cerevisiae مورد بررسی قرار گرفت. آنزیم پیروات دکربوکسیلاز مخمر قادر است بنزآلدئید را طی یک واکنش بیوشیمیایی به L-PAC تبدیل نماید. ابتدا توانایی سلولهاي آزاد مخمري رشد داده شده در شرایط هوازي و یا بیهوازي با استفاده از غلظتهاي متفاوت بنزآلدئید براي انجام این تبدیل زیستی مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج نشان داد که سلولهاي مخمري رشد داده شده در شرایط بیهوازي به علت فعالیت بیشتر آنزیم پیروات دکربوکسیلاز 2 برابر بیشتر L-PAC تولید میکنند. همچنین غلظتهاي بیش از 200 میکرومولار از بنزآلدئید اثر بازدارنده از خود نشان داد. در مرحله دوم تولید L-PAC به وسیله سلولهاي آزاد و تثبیت شده برروي آلژینات کلسیم مقایسه شد. تثبیت سلولها بر روي بستر ضمن افزایش مقاومت سلولها نسبت به بنزآلدئید، امکان استفاده چندین باره از سلولهاي مخمري براي انجام این واکنش زیستی را فراهم نمود.
مقدمه:
افدرین یک ماده مهم مورد استفاده در صنایع دارویی با خواصی مانند ضداحتقان، ضدحساسیت میباشدو اخیراً نیز به عنوان ماده ضد چاقی مصرف میشود. این ماده به طور سنتی از گیاه افدرا استخراج میشود اما به علت توزیع جغرافیایی محدود این گیاه، افدرین به روشهاي دیگري همچون سنتز شیمیایی و میکروبی نیز تولید میگردد. در تولید میکروبی، ابتدا ترکیب -Lاستیل فنیل کربینول - - L-PAC با استفاده از سلولهاي میکروبی تولید شده - شکل - A-1 و سپس این پیش ماده طی یک واکنش شیمیایی دو مرحلهاي به افدرین تبدیل میگردد
شکل .A -1 واکنش تبدیل زیستی بنزآلدهید به - L-PAC - و -B واکنش شیمیایی دو مرحلهاي تبدیل L-PAC به افدرین میکروارگانیسمهاي مختلفی براي تولید L-PAC استفاده میشوند که مخمر ساکارومایسس سروزیه نیز جزو این دسته است. تولید L-PAC در سلولهاي مخمري طی یک واکنش تبدیل زیستی انجام میشود، بدین نحو که سلولهاي مخمري در یک واکنش تراکمی، بنزآلدهید را با پیرووات ترکیب کرده و L-PAC را تولید میکنند.
واکنش کلیدي در تولید این ماده، کربوکسیله شدن پیرووات توسط آنزیم پیرووات دکربوکسیلاز - PDC - و تولید استالدهید فعال است که با بنزآلدهید ترکیب شده و L-PAC را تولید میکند. در فرایند تولید L-PAC غلظت بیش از حد سوبسترا اثر ممانعت کنندگی بر روي فعالیت آنزیم PDC دارد.[1] براي رفع این مشکل اغلب، سلولها را بر روي بسترهایی تثبیت میکنند تا از اثر ممانعت کنندگی سوبسترا کاسته شود. در این پروژه ابتدا اثر شرایط هوازي و بیهوازي و غلظت بهینه سوبسترا بر تولید محصول بررسی شده و سپس سلولها را درون آلژینات کلسیم تثبیت کرده و میزان تولید محصول در این حالت با تولید محصول توسط سلولهاي آزاد مقایسه شد.
-2 مواد و روشها
1-2 مواد
تمامی مواد و حلالهاي مورد استفاده در این پژوهش محصول شرکت مرك آلمان بوده و هیچ فرایند خالص سازي بر روي مواد انجام نشده است.
2-2 روشها
.1-2-2 کشت سلولهاي مخمرآزاد
سلولهاي مخمرآزاد در 100 mlمحیط کشت حاوي 1 grعصاره مخمر، 2 gr پپتون و 2 gr گلوکز و در شرایط هوازي و بیهوازي رشد داده شدند. براي بیهوازي سازي محیط کشت، محیط به مدت 1h با گاز نیتروژن هوادهی شد. پس از رسیدن سلولها به مرحله رشد لگاریتمی، به میزان 3 گرم وزن مرطوب از سلولها برداشته شده و درون 100 mlمحلول تبدیل زیستی که حاوي 0/6 و 3 گرم پپتون و گلوکز بترتیب بود تلقیح شد.
1 ساعت پس از تلقیح مخمر درون مایع تبدیل زیستی، بنزآلدهید در غلظتهاي مختلف به هر کدام از ارلنهاي کشت اضافه شد. در بازههاي زمانی مختلف نمونه برداري از محیط انجام گرفته و پس از سانترفیوژ کردن، مایع رویی برداشته شده و با حلال دي کلرومتان استخراج انجام شد. نمونهها با دستگاه گرماتوگرافی گازي مورد سنجش قرار گرفته و میزان غلظت محصولات و مواد اولیه اندازه گیري شد.
.2-2-2 تثبیت سلولهاي مخمري درون آلژینات کلسیم
براي تثبیت سلولهاي مخمري درون کلسیم آلژینات، 3 گرم وزن مرطوب از سلولهاي مخمري را جدا کرده با 10 ml آب مفطر استریل مخلوط کرده و درون 35ml محلول سدیم آلژینات با غلظت 40 - gr/ml - میریزیم. سپس سوسپانسون سلولی مذکور را به صورت قطره قطره درون محلول کلرید کلسیم 20 - gr/ml - میریزیم. با ریختن سوسپاسیون سلولی در محلول نمک، بیدهایی آلژیناتی تشکیل میشود که حاوي سلول هستند. بیدهاي مذکور را پس از گذشت 24 ساعت از محلول نمک جداکرده و با آب مقطر استریل شسته و به محیط تبدیل زیستی انتقال میدهیم. افزایش سوبسترا همانند سلولهاي آزاد بوده و مراحل نمونهگیري و سنجش محصولات نیز همانند سلولهاي آزاد و با دستگاه کرماتوگرافی گازي انجام شد.
-3 نتایج و بحث
تبدیل زیستی بنزآلدهید به L-PAC با استفاده از رشد سلولها در شرایط هوازي و بیهوازي و انتقال این سلولها به محیط تبدیل زیستی بررسی شد و نتایج نشان داد که در شرایط رشد بیهوازي به علت تولید بیشتر آنزیم پیرووات دکربوکسیلاز در مرحله تبدیل زیستی محصول بیشتري تولید میگردد.
علاوه بر این میزان اثر بازدارندگی سوبسترا بر روي سلولها نیز بررسی شد و نتایج - شکل-2الف - نشان داد که غلظتهاي بالا از سوبسترا اثر ممانعت کننده بر روي تولید محصول دارد. همانطور که در شکل -2 الف نمایش داده شده است، تولید محصول در 27 ساعت پس از افزایش سوبسترا با غلظت 200 به بیشترین مقدار خود - 1197mg/L - میرسد. در مورد سوبستراهاي با غلظت 400 و 600 میکرومولار میزان تولید محصول در 45 ساعت پس از اضافه کردن سوبسترا ثابت شده و هیچ تغییري در غلظت محصول و سوبسترا مشاهده نشد که علت را میتوان به اثر ممانعت کنندگی سوبسترا نسبت داد.
