بخشی از مقاله
مقدمه:
لیشمانیوز جلدی (سالک) یکی از بیماری های بومی اکثر نقاط کشـور بـه شـمار مـی رود .(1) تـلاش های مداوم جهت کنترل و پیشـگیری این بیماری تاکنون موفقیت آمیز نبوده است .(2) جهت کنترل لیشمانیوز جلدی از روش های مبارزه با ناقلین، از بین بردن مخـازن و ایمـن سـازی افـراد سـالم مـی توان استفاده نمود .(3)
لیشمانیزاسیون به عنوان یک روش کارآمد جهت کنترل لیشمانیوز جلـدی خصوصا در مناطق اندمیک این بیماری در ایران و بعضی ازکشورهای جهان مورد استفاده قرار گرفته است .(4-6) براساس مطالعـات انجـام شـده، لیشمانیزاسـیون مـیزان عفونت لیشمانیوز پوسـتی را بـا نسـبت های 1 به 6 تا 1 به 8 تقلیل داده و از ابتلاء طبیعی %86/9 افراد لیشمانیزه جلوگیری کرده است .(7)
در بـرنامه لیشمانیزاسـیون از پروماسـیتگوت های زنده و فعال لیشـمانیا ماژور که در محیطNNN کشت داده شده بودند، استفاده مـی گـردید. اینگونه از انگل لیشمانیا با لیشمانیا تروپیکا ولیشمانیا پاناماننسیس ایمنی متقاطع دارد .(8)
بـه علت حمل و نقل، تغییر شرایط محیطی و گاهی تأخیر در زمـان تلقـیح، تعـداد پروماستیگوت ها، نحوه فعالیت و زنده ماندن آنهـا دچـار تغییرات قابل ملاحظه ای می شدند و لذا علاوه بر آنکه مـیزان تلقـیح انگـل ها استاندارد نبود در عده ای از افراد لیشمانیزه ایمنی کامل در مقابل لیشمانیوز جلدی بوجود نمی آمد و این افراد در اثـر گـزش پشـه خاکـی هـای آلوده به لیشمانیوز جلدی مبتلا مـی گـردیدند .(9) عـلاوه بـر آن در حال حاضر از لیشمانیزاسیون جهـت ارزیابی واکسنهای لیشمانیوز جلدی استفاده میگردد 10)و
دکترمهدی محبعلی و همکاران
17
.(11 لـذا هـدف اصـلی ایـن مطالعه تهیه مایه لیشمن استاندارد و ارزشـیابی آن درموش های سفید کوچک آزمایشگاهی بوده است تا پس از حصول نتیجه مطلوب در انسان نیز مورد ارزیابی قرارگیرد.
روشکار:
الف- تهیه مایه لیشمن استاندارد :
ابتدا انگل لیشمانیا ماژور سوش اصفهان (MRHO/IR/75/ER)
کـه در سـال 1964 از یـک عـدد رومبومیس استان اصفهان جدا شـده بـود و قـبلاً نـیز مایـه لیشـمن در ایران از این سوش تهیه مـی گـردید در محـیط RPMI1640 حـاوی 20 درصد سرم جنین گوسـاله کشت گردید. پس از انجام آزمایش لازم از نظر حضور و زنـده بـودن پروماسـتیگوت هـا، هر 72 ساعت یکبار بر حجم این محیط ها افزوده گردید. به طوریکه پس از گذشت 120 ساعت پس از پاســاژ چهــارم مــیزان 300 میلــیلیــتر محــیط کشــت حــاوی پروماستیگوت های زنده و فعال تهیه گردید. جهت کشت از دمای 26 oC و همزن با دور 60rpm استفاده گردید.
بـه مـنظور تهـیه مایـه لیشمن استاندارد مراحل زیر به ترتیب انجام گردیدند:
-1 یکـبار شستشو با سانتریفوژ یخچالدار با دور 3000rpm
در دمای .4oC
-2 سه مرتبه شستشو با سرم فیزیولوژی 9 در هزار با rpm
2500 مطابق روش فوق.
-3 تهـیه سوسپانسـیون انگلـی در سـرم قـندی– نمکی با pH=7.2 و گلیسرول 10 درصد.
-4 تأیـید مـرحله فـاز ایسـتای رشـد بـا اسـتفاده از روش
.(12) peanut agglutination test
-5 تنظـیم پروماسـتیگوت هـا بـه میزان 20 میلیون در هر میلیلیتر و شمارش آنها با لام توما و یا نئوبار.
-6 تقسـیم آنهـا در ویال های استریل به طوریکه هر ویال حاوی یک میلیلیتر مایه لیشمن باشد.
-7 کنـترل مایه لیشمن تهیه شده ازنظر وجود باکتری های هوازی و بی هوازی با استفاده از محیط های آگار خوندار و تیوگلِیکولات.
-8 کنـترل زنـده بـودن پروماسـتیگوتهـا قـبل و پـس از گلیسرینه کردن.
-9 تلقـیح 0/1 میلی لیتر از مایه لیشمن تهیه شده به قاعده دم ده عـدد مـوش Balb/C بـه روش زیر جلدی جهت مطالعه عفونتزائی آن در حیوان حساس.
انجمـاد نمونـه ها به شکل تدریجی انجام می گردید به طوریکه هـر یـک از نمونه ها نیم ساعت در حرارت آزمایشگاه و یک هفته در بـرودت 85oC نگهـداری شـده و سـپس بـه تانک های حاوی نیتروژن مایع با برودت -196oC منتقل میگردیدند.
ب: نحوه بررسی مایه لیشمن استاندارد در حیوانات حساس
آزمایشگاهی:
تعداد 250 عدد موش سوری 6-8 هفته ای ماده در قفس های جداگانـه در حـیوانخانه دانشـکده بهداشـت دانشگاه علوم پزشکی بقیه اله نگهداری گردیدند. پس از دو هفته 237 عدد از موش های باقیمانده به دو گروه به شرح زیر تقسیم شدند:
-1 گـروه تحـت مداخلـه: تعـداد 135 عـدد از موش های سوری بـه وسـیله 0/1 میلـی لیـتر مایـه لیشمن استاندارد مورد تلقیح قرار گرفتـند. تزریقات زیر پوستی و در قاعده دم حیوانات مذکور انجام گـردید. قـبل از تلقـیح، هـر یک از لوله های محتوی مایه لیمشن منجمد شده به مدت دو دقیقه و 15 ثانیه در داخل بن ماری 37oC قـرار داده شـدند و از 10تـا20 دقیقه پس از بازیافت مورد استفاده قـرار گرفتند. در این مرحله هر سری مایه لیشمن با میکروسکوپ زمیـنه سـیاه و بـا درشـتنمائی 400× مـورد بررسی قرار گرفتند و بدینوسیله نمونه های فاقد پروماستیگوت های زنده از مطالعه خارج شدند.
-2 گـروه کنـترل: تعـداد 102 عدد از موش های سوری به عنوان گـروه کنـترل به وسیله 0/1 میلی لیتر سرم فیزیولوژی 8/5 درصد بـه روش فـوق مـورد تـزریق قـرار گرفتند. تمامی حیوانات تحت مطالعـه هفـته ای یکـبار بـه مـدت 6 مـاه از نظـر ظهور ضایعات لیشمانیوز جلدی در محل تلقیح، مورد معاینه قرار گرفتند.
