بخشی از مقاله
بررسي تأثيرمقدار مايه تلقيح ، غلظت قند وافزودن ويتامينها در فرآيند صنعتي تخمير الکلي
در مقياس آزمايشگاهي
چکيده
امروزه اتانول زيستي همچنان جزء مهمترين محصولات زيست فناوري مي باشد. مخمر Saccharomyces cerevisiae، در ايـن صنايع بيشترين کاربرد را دارد و ملاس نيز به واسطه فراواني و ارزان قيمت بودن و دارا بودن مقادير بالاي مواد قنـدي در ايـران ، منبع کربن مناسبي براي توليد اتانول محسوب مي شود. هدف از اين بررسي ، در مرحله اول ، بهينـه سـازي مقـدار مايـه تلقـيح و سپس بهينه سازي غلظت قند محيط کشت است . با توجه به اهميت ويتامينها، اثر دو ويتامين بيوتين و اسيد پانتوتنيک نيز بررسـي شد. ابتدا آناليز کاملي از ملاس نيشکر انجام ، و بر اساس اجزاء آن و فرمول عمومي مخمر، ترکيب محيط کشتي مطابق بـا صـنايع توليدي ترتيب داده شد. در ادامه ، درصدهاي مختلف مايه تلقيح ، افزوده و بازده و بهره وري مربوطه محاسبه و تحليل آماري شد.
نتايج حاکي از آن است که ميزان مايه تلقيح v.v ٤ درصد بالاترين بهره وري توليـد اتـانول را دارا مـي باشـد. سـپس بريکسـهاي مختلف ملاس مطالعه شد. نتايج نشان داد که بريکس ١٧.٥(غلظت قند:g.l ١١٠)، بالاترين بهـره وري را دارد. همچنـين افـزودن بيوتين به محيط کشت ، تأثير قابل ملاحظه اي بر بهره وري تخمير ندارد. در حالي که وجود اسيد پانتوتنيک ، باعث کـاهش زمـان تخمير و افزايش بهره وري توليد مي شود.
مقدمه
اتــانول ، کاربردهــاي فراوانــي در صــنايع رنــگ ســازي ، داروسازي ، مواد شوينده و غيره دارا مي باشد (١٧). عـلاوه بر اين ، امروزه بهره گرفتن از اتانول به عنوان سوخت برتـر و سبـز، بسيار مورد توجه مي باشد (٢٠). توليـد الکـل بـه روش تخمير، سالهاي زيادي است کـه در مقيـاس صـنعتي انجام مي شود، با اين حال هنـوز هـم مسـائل ناشـناخته و مبهمي در اين فرآينـد وجـود دارد. تخميـر کـه قلـب ايـن فرآيند زيستي را تشکيل مي دهـد، بـه دليـل پيچيـدگيهاي خود به عنـوان جعبـه سـياه صـنعت توليـد الکـل شـناخته مي شـود. Saccharomyces cerevisiae ، متـداول تـرين و بهترين ميکروارگانيسمي است که در توليد صنعتي اتانول از گلوکز مورد استفاده قرار مي گيرد (١٤). در ايران بـه دليـل وجودکارخانه هاي قند و شـکر، از مـلاس کـه مـازاد ايـن کارخانه هاست ، استفاده مي کنند.
در برزيل سـانچز و همکـارانش در سـال ١٩٩٦ و ويلـز و همکارانش در سال ١٩٩٩ از نخستين افرادي بودنـد کـه در زمينه توليد اتانول از ملاس نيشکر فعاليت وسيع داشته انـد (١٦). تحقيقات بعدي نشان داد ترکيب محيط کشت تـأثير بسزايي بر ميزان بازدهي فرآيند تخمير الکلي دارد. در سـال ١٩٣٥، رگياند گزارش کرد که غلظت بالاتر مخمر، سـرعت تخمير را بالا مي برد (٨). اين در حالي است که بررسيهاي فالکون در سال ١٩٦١ و بورزاني در سـال ٢٠٠٦ حـاکي از آن است که افـزايش غلظـت مايـه تلقـيح منجربـه کـاهش کارايي تخمير الکلي مي شود (٥).
تحقيقات ديگر نشان داد که غلظت قنـدهاي قابـل تخميـر محيط کشت ، تأثير بسزايي بر ميزان بازدهي فرآينـد تخميـر الکلـي دارد. الـورزا درسـال ١٩٧٧ و ويتولـو درسـال ١٩٩٥ اظهار داشتند که غلظتهاي بـالاي گلـوکز اثـر مهارکننـدگي وسيعي برروي فعاليتهاي آنزيمي بويژه اينورتاز دارد (٢٦ و ٣١). از طرف ديگرتحقيقات بورزاني درسـال ٢٠٠٦ نشـان دادکه با افزايش غلظت قنـد محـيط کشـت ، مقـدار اتـانول توليد شده افزايش مي يابـد امـا درميـزان بـازده محصـول ، افزايش قابل ملاحظه اي مشاهده نمي شود (٥). بررسـيهاي بورخولدر در سال ١٩٤٤، کنـاب و زالمـن در سـال ١٩٦٤، موئات و آلفنور در سال ٢٠٠٤ و وازکوئيز در ٢٠٠٥ نشـان داد که با افزودن ويتامين از جمله بيوتين و اسـيدپانتوتنيک مي توان توليد اتانول را تا حدود v.v ١٩ درصد افزايش داد ( ٣، ١٦، ٢٠ و ٣٠).
بررسي منابع اين فرضيه را مي رساند که ممکن است علت تفاوت در نتايج اشاره شده ، تفـاوت در سـويه هـاي مـورد مطالعه و يا غلظتهاي متفاوت مواد مغذي محيط کشت بوده باشد. لذا رنج وسيعي از غلظتهاي مختلف براي يک سـويه صنعتي و در يک محيط کشت کاملا صنعتي بررسي شد تـا فرضيه هاي فوق مورد ارزيابي قرار گيرد.
مواد و روشها
به منظور تهيه محيط کشت ، بررسـي کيفيـت منبـع کربنـي مورد استفاده يعني ملاس نيشکر خوزستان ، ضروري به نظر مي رسد. به ايـن منظـور، درصـد رطوبـت ، بـريکس ، pH، خاکستر خام ، ميزان قندهاي احياکننـده بـه روش فهلينـگ ، درصد سوکروز به روش دابل پلاريزاسيون ، درصد قند کـل بر اساس قندهاي احيا کننده ، ميزان نيتروژن کـل بـه روش کجلــدال ، فســفات بــر حســب PO٢٥ ،کلســيم و منيــزيم ، سولفات ، ميزان SO٢ و NO٢ بررسي شـد (٩، ١٠، ١١، ١٢ و .(13
روشهاي آناليز: تعيين ميـزان نيتـروژن (روش کجلـدال ):
هضم : جهت آناليز ملاس ،٢ گـرم و دي آمونيـوم فسـفات ، اوره و ســولفات آمونيــوم ٠.٢ گــرم را درون يــک ظــرف کجلدال وزن و سپس ٢٠ ميلي ليتر اسيد سولفوريک غلـيظ و ٣ دانه سنگ جوش شيشه اي و يـک قـرص کجلـدال يـا
٠.٥گرم مخلـوط کجلـدال بـه آن افـزوده و درون دسـتگاه هضم کجلدال قرار داده شـد. زمـان لازم بـراي جوشـاندن حدود ٢ ساعت مي باشد. بالنهـا در دمـاي محـيط سـرد و براي تقطير استفاده شدند.
تقطير: ٥ ميلي ليتر محلول اسـيد بوريـک درون يـک ارلـن ماير ريخته و تقريبا چهـار قطـره مخلـوط شناسـاگر بـه آن اضافه شد و بالن در دستگاه تقطير قرار گرفت و بـه نمونـه هضم شده آنقدر سود w.v٣٥ درصد اضافه شد تا رسـوب به دست آيد. ١٥٠ ميلي ليتـر از محلولهـا درون يـک ارلـن ماير، تقطير شد و مـايع حاصـل بـا اسـيد کلريـدريک ٠.١ نرمال تيتر گرديد. تغييـر رنـگ از سـبز بـه قرمـز کمرنـگ مي باشد. يک نمونه شاهد با ١٠ ميلي ليتر آب مقطر با همان روشـي کـه بـراي نمونـه گفتـه شـد تهيـه ، تقطيـر و تيتـر گرديد(١١).
A = ميلي ليتر مصرفي اسيد کلريدريک N٠١ براي نمونه
B = ميلي ليتر مصرفي اسيد کلريدريک N٠١ براي شاهد
تعيين ميزان فسفات (P2O5): آماده سازي نمونه مشابه با مرحله هضم تعيين ميزان نيتروژن است . محتوي بالن هضم ، به يک بالن ٢٥٠ ميلي ليتري منتقل و با آب مقطر به حجم رسيد. ٢٥ ميلي ليتر از محلول ، در حضور فنل فتالئين با هيدروکسيد سديم (g.l١٠٠) خنثي و سپس ١٠ ميلي ليتر معرف فسفات اضافه و پس از به حجم رسيدن جذب نوري در طول موج ٦٥٠ نانومتر در مقابل نمونه شاهد اندازه گيري و مقدار P2O5 از روي منحني کاليبراسيون تعيين شد (١١).
اندازه گيري ميزان اتانول توليد شده : اين آناليز به وسـيله ١ ميلي ليتر از نمونه و با کمک روش دي کرومات پتاسـيم انجام گرفت (١). منحني استاندارد به وسيله تقطيـر مقـادير 10μl تا 100μl الکل مطلق و اندازه گيري جذب در طـول موج nm582 (مطابق با روش مذکور) ترسيم شد.
اندازه گيري ميزان قند مصرف شده : روشي که بـه منظـور تعيين ميزان قند استفاده گرديد، موسوم به روش سموگي – نلسون مي باشد (٧). براي رسـم منحنـي اسـتاندارد نيـز از محلول گلوکز 10g.l استفاده شد. با کمک منحني استاندارد و تأثير ضريب رقت ، مقدار قند باقيمانـده در نمونـه هـا در طول موج 520nm ارزيابي گرديد.
بازدهي : ميزان اتانول توليد شده به ازاء ميزان قنـد مصـرف شده را بازده توليد اتانول مي نامند (٤و٥).
Y =بازده ، E p =غلظـت اتـانول توليـد شـده (g.l) ،S = مقـــدار قنـــد مصـــرف شـــده
بهره وري : در کارخانجات و صـنايع توليـدي ، بهـره وري فـاکتور تعيـين کننـده بـوده و محـور ارزيـابي توليـد قـرار مي گيرد و عبارتست از ميزان اتانول توليد شده در واحـد زمان (21).P = بهره وري ، t = زمان تخمير
E p.t =P
محيط پيش کشت (مايه تلقـيح ): مخمـر مـورد بررسـي ، سويه Saccharomyces cerevisiae صنعتي مولد اتانول مي باشد که از يکي از مراکز توليدي الکل تهيه شده است . ابتدا کشت ٢٤ ساعته اي از سويه مـورد نظـر بـر روي اسـلنت
Yeast extract Glucose Chloramphenicol Agar در دماي ٣٠ درجه سانتي گراد تهيـه شـد. سـپس مخمرهـا در محــيط کشــت مــايع Yeast extract Malt extract در انکوباتور شيکر(دمـاي ٣٠ درجـه سـانتي گـراد بـا سـرعت 150rpm) رشد داده شدند (٣٢). هر دو ساعت يک بـار در شرايط کاملا استريل ، از آنها نمونه بـرداري و وزن خشـک مخمر محاسبه ، منحني رشد مخمر ترسـيم و بهتـرين زمـان تلقيح يعني زماني که مخمر در اواخر فـاز لگـاريتمي رشـد است ، ارزيابي شد.
محيط کشت توليد: به منظور تهيه محيـط کشـت صـنعتي ، فرمــول عمــومي مخمــر (CHON٦١٠٩٣٠٦١٠٣) و درصـــد ترکيب مواد تشکيل دهنـده آن به طور دقيق با نتايج حاصل از آناليز ملاس مقايسه شـد. نتـايج حـاکي از آن اسـت کـه افــزودن مــواد معــدني همچــون Ca و Mg ضــرورتي ندارد(جدول ١)، ليکن منابع تغذيه اي مناسبي جهت تـأمين سطوح مورد نياز N و P لازم اسـت . از آنجـايي کـه منـابع نيتروژن و فسفات محيط کشت نيز کاملا صـنعتي انتخـاب شدند، اندازه گيري ميـزان خلـوص آنهـا بـراي محاسـبات محيط کشت لازم مي باشد. منبـع نيتـروژن مـورد اسـتفاده ، مطابق صنايع توليدي ، ٧٠ درصد اوره و ٣٠ درصد سولفات آمونيــوم ، و منبــع فســفات نيــز دي آمونيــوم فســفات صنعتي (DAP) انتخـاب شـد. از آنجـايي کـه دي آمونيـوم فسفات و اوره در دماي اتوکلاو تجزيـه مـي شـوند، ابتـدا فيلتر و سپس به محيط کشت افزوده شدند. بـراي محاسـبه مقادير اوره ، دي آمونيوم فسفات و سولفات آمونيـوم مـورد نياز ابتدا لازم است حداکثر مقدار ممکن مخمر موجـود در محيط کشـت محاسـبه شـود تـا از نظـر منـابع نيتـروژن و فسفات کمبودي ايجاد نگردد (١٩).
جهت محاسبات ، بالاترين مقدار تلقيح و غلظت قند مورد استفاده در مراحل بعدي (مقدار تلقيح ١٠ درصد (ml ٢٥)) و غلظت قند ملاس با بريکس ٢٥ (g.l١١٠) به کار برده شد.
محاسبات مربوط به محيط کشت :
بريکس اوليه : ٨٤.٨٥ جدول (١)
بريکس ثانويه : ٢٥ ٣.٣٩٤ = ٢٥ ÷ ٨٤.٨٥
ml ٢.٣٩٤ = ٢.٣٩٤ گرم آب , ml ٠.٧٠٦ =١ گرم ملاس
2.394 ÷ 0.706 = 3.39 => x + 3.39 x = 225 ml x =
51.25 ml =>
ملاس مصرفي g ٧٢.٥٧ = ٥١.٢٥ × ١.٤١٦ = v ×d =m
درصد وزني کل قند بر حسب = مقدار کل قند قابل تخمير ×١٠٠. ٥٣.٥ = وزن ملاس مصرفي ×قندهاي احيا کننده
72.57 = 38.83 g
بررسي منابع نشان مي دهد که در بهتـرين شـرايط تخميـر الکلي ، به ازاي هـر گـرم قنـد مصـرفي ، حـدود ٠.١٥گـرم بيومس توليد مي شود (١٥).
حداکثر بيومس توليدي g ٥.٨٢ = ٣٨.٨٣ × ٠.١٥ باتوجه به منحني رشد مخمر در بخش نتايج مايه تلقيح مورد استفاده نيز داراي بيومسي حدود g.l ٣.٥ مي باشد.
بنابراين : <=بيومس تلقيحي g0.0875 = l٠.٠٢٥ g.l * ٣.٥
مقدار کل مخمر g ٥.٩١ = ٠.٠٨٧٥ + ٥.٨٢
از آنجايي که حدود ٥ درصد خاکستر مخمر، ارتوفسفات و ٩.٨ درصد نيتروژن است ، محاسبات صنايع به صورت ذيل
مي باشد:
– ميزان فسفات موردنيازمخمر) = ميزان DAP مورد نياز
= (عکس درصد خلوص DAP ) × (ميزان فسفات ملاس
[(0.05 × 5.91) – (0.288)]× (100 ÷ 40.35) = 0.71 g
[ميزان نيتروژن مورد نياز مخمر] = ميزان نيتروژن مورد نياز نيتروژني که از منبع + ميزان نيتروژن موجود در ملاس )]-
[(ميزان دي آمونيوم فسفات تأمين مي شود
= [9.8 ÷ 100 × 5.91] – [(0.003 × 72.57) +(0.18 ×
0.6)] = 0.254g
از آنجايي که در صنايع توليدي ، نيتروژن مورد نياز را ٧٠ درصد اوره و ٣٠ درصد سولفات آمونيوم تأمين مي کند،
بنابراين :
(ميزان نيتروژن مورد نياز × ٧٠ درصد)= اوره مورد نياز
(٤٥.٢ ÷ ١٠٠)×(٠.٢٥٤ × ٠.٧)=(عکس درصد خلوص )×
=0.393g
ميزان نيتروژن × ٣٠ درصد ) =سولفات آمونيوم مورد نياز ( عکس درصد خلوص آن )×(مورد نياز
= (0.3 × 0.254) × (100 ÷ 20.3) = 0.375g
با کمک محاسبات ذکر شده وبا توجه به اينکه ايـن مقـادير براي ml ٢٥٠ محاسبه شده است ، به منظور اطمينان از عدم کمبود اين منابع ، غلظتهاي نهايي دي آمونيوم فسـفات g.l٣، اوره g.l٢و سولفات آمونيوم g.l٢ به کار برده شد.
محيط کشت توليد(صنعتي ) جهت بهينـه سـازي مقـدار مايه تلقيح : به اين منظور، از محيط کشت توليد پايه که در بخش قبل توضيح داده شد، استفاده گرديد. به ايـن ترتيـب که ٦ ارلن آماده شده ، به ترتيب با غلظتهاي ١، ٢، ٤، ٦، ٨ و ١٠ درصد از مايه تلقيح مذکور تلقيح شدند و در انکوبـاتور شيکردار(٣٠ درجه سانتي گراد بـا سـرعت rpm ٧٠) قـرار داده شدند.
محيط کشت توليد(صنعتي ) جهت بهينه سـازي غلظـت قند محيط کشت : در اين مرحلـه غلظتهـاي مختلـف قنـد محيط کشت بررسي شد. به اين منظور، ارلنهاي ٥٠٠ ميلـي ليتري محتوي ٢٢٥ ميلي ليتر ملاس نيشـکر بـا بريکسـهاي مختلف ١٠، ١٢.٥، ١٥، ١٧.٥، ٢٠ ،٢٢.٥ و ٢٥ بـا ٤.٥= pH
(٣١) و اتوکلاو شده (١١٠ درجه سانتي گراد بـه مـدت ١٠ دقيقه ) آماده و محلول افزودني مطابق محيط کشـت توليـد افزوده شد (٢٧). سپس بهترين غلظت يعنـي v.v ٤ درصـد مايه تلقيح افزوده و ارلنها در انکوباتور شيکردار(٣٠ درجـه سانتي گراد با سرعت rpm ٧٠) قرار داده شدند.
محيط کشت توليد(صنعتي ) جهت بررسي تأثير غلظتهاي مختلف بيوتين : به منظورتهيه محيط کشت در اين مرحلـه ، از نتايج مراحل قبلي استفاده گرديد، به ايـن ترتيـب کـه ٥ ارلن ٥٠٠ ميلي ليتري محتوي ٢٢٥ ميلي ليتر ملاس نيشـکر جلد ٢٣، شماره ٢، ١٣٨٩ با بـريکس ١٧.٥ بـا ٤.٥= pH (٣١) و اسـتريل شـده (١١٠ درجه سانتي گـراد بـه مـدت ١٠ دقيقـه ) آمـاده و محلـول افزودنـي مشـابه مراحـل قبـل افـزوده شـد. سـپس (v.v ٤ درصد) از مايه تلقيح اضافه شد. محلول بيوتين فيلتـر شـده نيــز بــا غلظتهــاي μg.l٣٠٠، μg.l٦٠٠، μg.l٩٠٠، و mg.l ١.٢ اضافه گرديد. يک ارلن نيز به عنوان نمونه شاهد مورد مطالعه قرار گرفت . سپس ارلنها در انکوباتور شـيکردار(٣٠ درجه سانتي گراد با سرعت rpm ٧٠) قرار داده شدند.
محيط کشت توليد(صنعتي ) جهت بررسي تأثير غلظتهاي مختلف اسيد پانتوتنيک : ٥ ارلن مشابه مرحله قبل تهيه شد با اين تفاوت که در اين بررسي ، به جاي بيوتين ، پانتوتنـات کلسيم فيلتر شده به ارلنها افزوده شد و غلظتهاي زير مـورد ارزيابي قرار گرفـت . mg.l ٣، mg.l٦، mg.l ٩ و mg.l ١٢. يک ارلن نيز به عنوان نمونه شاهد و بـدون اسـيدپانتوتنيک مورد مطالعه قرار گرفت .
نتايج
بر اساس روشهايي که در بخش روشهاي آناليز ارائه شـده ، ملاس ، دي آمونيوم فسفات ، اوره و سولفات آمونيوم مـورد استفاده ، آناليز و نتايج آنها در جداول ١و ٢ ارائه شده است .
جدول ٢- نتايج آناليز منابع نيتروژن و فسفات محيط کشت صنعتي و ميزان خلوص آنها بر اساس درصد وزني .وزني
