دانلود مقاله مقدمه ای بر بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی

بخشی از مقاله

مقدمه:
يكي از زمينه هاي كه امروزه بيوتكنولوژيست ها روي آن تحقيق مي كنند ايجاد گونه هاي ترانسژنيك است. طبق تعريف ترانسژنيك موجودي است كه، داراي DNA نو تركيبي باشد. به طوري كه در ژنوم آن موجود ژن نو تركيب بيان مي شود. بيان ژن خارجي يكي از جنبه هاي توليد ترانسژنيك و انتقال DNA به زاده هاي هدف بعدي مي باشد. در اين زمينه تكنيك ميكرواينجكش در انتقال ژن به تخم مهره داران اولين بار به وسيله گوردون (Gordon) و همكاران در سال 1980 گزارش شد. در اين تكنيك يك لوله مؤئين شيشه اي را براي وارد كردن DNA نو تركيب به پيش هسته نريا با سيتوپلاسم تخم لقاح يافته موش به كار گرفتند. در همين سال ميكروانجكش مستقيم DNA نو تركيب در شرايط آزمايشگاهي جهت ايجاد حيوانات ترانسژنيك مورد استفاده قرار گرفته است. طوري كه ژن را از اين طريق وارد تخم هاي لقاح نيافته يا لقاح يافته

موجوداتي نظير جنين توتياي دريايي،‌ موش،‌ قورباغه، مگس سركه، خرگوش و خوك كرده اند (Brem 1988) در سال 1985 زئو (Zhu) و همكاران ژني شامل پرتومتالوتيونين موش و ژن هورمون رشد انساني را به ناحيه مركزي صفحه زاياي تخم هاي لقاح يافته ماهي طلايي تزريق كردند و قسمتي از اين ژن را در DNA ماهيان مشاهده كرند. در همين سال روكونس (Rokkones) تكنيك ميكرواينجكشن دو مرحله اي بر روي تخم آزاد ماهيان را شرح داده است. در اين تكنيك ابتدا به كمك يك وسيله نوك تيز فلزي در قطب حيواني سوراخي ايجاد شده و از طريق اين سوراخ محلول حاوي DNA نو تركيب به كمك پي پت ريز تخم شدند به طوري كه به كيسه زرده وارد نشوند. پس از 14 روز پلاسميدهاي كامل را مشخص كردند. چوروت (Chourrout) و همكاران در سال 1986 روش فوق را بر روي قزل آلاي قهوه اي رنگ به كار برند با توجه به وجود DNA خارجي همراه با ملكولهاي DNA ميزبان پيشنهاد شده كه اين ژن به داخل ژنوم ماهي وارد شده است. محققان به ورش دستي يا از طريق هضم آنزيمي از جمله با تريپسن

كوريون را برداشته و تزريق ميكرواينجكشن انجام دادند. در همين سال اوزاتا (Ozata) ماهي كوچك مدوكا را به عنوان مدلي براي ترانسژنيك مطرح كرد. او پلاسميدهاي حاوي ژن كريستالين جوجه را به هسته تخم ها از طريق ميكرواينجكشن وارد كرد. به علت كوريون سفت در تخم لقاح يافته تعدادي از ماهيان استفاده از ميكرواينجكشن مشكل و مستلزم اتلاف وقت زيادي است. به همين منظور روشهايي جهت غلبه بر اين مشكل به كار گرفته شده است. از جمله در سال 1988 بريم (Brem) و همكاران ژن هورمون رشد انسان را به كمك وكتور مناسب از طريق ميكروپيل به صفحه زاياي تخم هاي تيلاپيا تزريق كردند و رشد بچه ماهيان طي 90 روز بررسي شد. مشابه اين

تحقيق توسط فلت چر (Fletcher) و همكاران در همين سال بر روي ماهي آزاد اتلانتيك انجام شد. همچنين تكنيكهاي ديگر شامل الكتروپورشن (Electroporation) شليك ذرات ژن Shatagun بر روي تخمك و طراحي ليپوزوم جهت ورود به زرده تخم انجام شده است. ميكر واينجكشن نياز به مهارت زيادي دارد و از طرفي سرعت آن كم و هزينه و تجهيزات آن زياد است و مستلزم زحمات و زمان زيادي براي ايجاد تعداد زيادي از ما هيان ترانسژنيك است علاوه بر اين از ديگر مشكلات آن اين است كه در تخم هاي القاح يافته اغلب ماهيان هسته به وسيله ميكرسكوپ قابل روئيت نيست بنابراين DNA را به سيتو پلاسم تزريق مي كنند.

در مجموعه تحقيقات انجام شده، ميزان باقي ماندگي جنين هايي كه مورد تزريق قرار گرفته اند بين 50 تا 80 درصد گزارش شده است. و كارآيي ميزان بيان ژن بين 3 تا 70 درصد بوده است. باقي ماندگي جنين ها و كارايي بيان ژن وابسته به فاكتورهايي نظير سيستم بافري، غلظت DNA و روش هاي مورد استفاده در تزريق مي باشد. لذا در مراحل بعدي غلبه بر اين مشكلات مورد توجه قرار گرفت به طوري كه ضمن ساده كردن تكنك و كم كردن هزينه ها كارآيي را افزايش مي دهند تا در عمل بتوان در تكنولوژي تكثير و پرورش آبزيان تعداد زيادي از ماهيان ترانسژنيك را ايجاد كرد. بنابراين روش استفاده از اسپرم جهت انتقال ژن مطرح شد. اگر چه مفهوم بكارگيري اسپرم به عنوان يك ناقل مسئله جديدي نيست بلكه در سال 1971 براكت (Brackett) با وارد كردن ژن خارجي به اسپرم خرگوش و در سال 1987 فريمن (Fareeman) بر روي ماكيان اين تحقيق را انجام داده اند و در سال 1989 لويترانو (Lavitrano) اين تكنيك را بر روي موش به كار گرفته است. در سال 1992 كهو (Khoo) تكنيك استفاده از اسپرم به عنوان ناقل را جهت وارد كردن ژنهاي جديد به ماهي زبر به كار گرفت. همچنين در سال 1993 ايكسي (Xie) و همكاران جزئيات انتقال ژن از طريق اسپرم به كمك التروپورشن (Electroporation) بر روي ماهيان لوچ (Loach) و كاراس (Crucian) را شرح داده اند. در همان سال (سين) Sin و همكاران انتقال ژن به ماهي چنوك (Chinook) را با همين تكنيك شرح دادند. در اين نوشتار جزئيات دستكاريهاي ژني در ماهيان با ذكر مثالهايي بررسي شده است.
1-1- به كار گيري پروموتر از ژن ماهيان
گزارشهاي اندكي در ارتباط با تحقيقات به كارگيري پروموتر از ماهي در دسترس است. در ماهي قزل آلاي رنگين كمان دو فرم مشابه از ژنهاي متالوتيونين بنام B,A وجود دارد. اگر چه پروموترژن B قادر به بيان ژن گزارشگر در محيطهاي كشت سلولي است. ولي درباره اين ويژگي پروموترژن B در سلولهاي ماهي اطلاعات كمي وجود دارد. به منظور طراحي و كتورهاي مناسب براي ما هي و مطالعه تنظيم بيان ژن در داخل بدن و شرايط آزمايشگاهي پروموترن ژن B متالوتيونين ماهي قزل آلا جدا شد. پس از PCR نقش آن در بيان ژن در لاينهاي سلولي انسان و ماهي توسط هونگ (Hong) به كار گرفته شد. به همين منظور وكتور بنام PtMTb – CAT كه داراي 6/4 كيلوباز است

طراحي گرديد. حدود 261 حفت باز وكتور مربوط به پروموترژن B متالتيونين قزل آلاي رنگين كمان (tMTb) كيلو باز آن ژن كلرامفنيكل استيل ترانسفراز (CAT) و سيگنال پلي ادنيلاسيون ويروس SV40 و همچنين 7/2 كيلو باز آن قطعه اي مربوط به پلاسميد PUC18 بوده است همچنين طراحي آن بر پايه ساختمان pBL – CAT تكميل شده بود. به طوري كه طراحي BL پرايمري داراي سكانس اوليگونكلئوتيدي بر اساس رديف نكلئوتيدهاي سمت 5 از 250 تا 221 ژن MTb ماهي قزل آلا بوده و داراي محل ويژه اي جهت

برش توسط آنزيم EcoRI بوده است. همچنين در ساختمان پلاسميد ptMTb – CAT قطعه 261 جفت بازي پروموتر tMTb در جلوي ژن CAT در ساختمان CAT pBL- قرار گرفته است. در كنار اين چهار وكتور ديگر طراحي گرديد، كه شامل pBL-CAT2-1 كه در آن پروموتر تيميدين كيناز (TK) ويروسي در بالا دست ژن CAT قرار داده شده بود. pBL-CAT3-2 بر اساس pBL-CAT2 كه در آن پروموتر TK برداشته بود طراحي شد pTK-CAT2E-3 كه در پلاسيميد PBL-CAT2 تعداد 72 جفت باز تكراري از اينهنسر SV40(Enhancer) به صورت دوبل به ابتداي ژن CAT اضافه شده بود. PhMT IIA-4 كه تعداد 850 جفت باز داراي محل ويژه برش Hind III/NcoI از پروموتر آن متالوتيونين IIA انساني (HmtIIA) به ژن CAT در ساختمان

pBL-CAT3 اضافه شده بود اين وكتورها به روي 4 لاين سلولي ماهي و يك لاين انساني به كار گرفته شدند. طوري كه در آن سلولها با ميزان 5/3 پيكومولار از DNA پلاسميد آلوده شدند جزئيات نتايج در جدول شماره يك آمده است.
جدول 1- سنجش فعاليت پروموتر در يك لاين سلولي انسان و چهار لاين سلولي ماهي

Cell lines Constructs
‍PSM A2 EPC RTH HepG2
0.43
n.b.c
100.00
0.55
0.43
(0)
0.40
(0)
0.96
13.26
(13.84)
5.66
(5.91) 0.52
n.b.c
100.00
0.74
4.53
(6.16)
11.62
(15.80)
3.71
99.28
(26.64)
98.12
(26.33) 0.27
3.67
100.00
0.5
10.95
(21.9)
1.02
(2.04)
3.68
139.00
(37.77)
106.67
(29.00) 1.16
3.14
100.00
1.40
39.11
(27.94)
7.18
(5.13)
14.11
480.69
(34.07)+227.48
(16.12) 0.13b
1.00
100.00
0.10
0.33
(3.30)
0.11
(1.10)
1.21
72.56
(69.20)
13.90
(11.50) pBL – CAT3
pBL – CAT2
pTK-CAT2E
ptMTb CAT
+zinc

+cadmium

phMTIIACAT
+zine

+cadmium

EPC (Carp epithelioma Papulosum) , PTH (Rainbaw trout hepatoma)
Hep (Human hepatoblastoma) , PSM (Xiphophorus interspecific melanoma) , A2 (xiphophorus xiphidium emryonal epitheloid )
جهت بررسي اثرالقاء فلزات بر روي ژن، لاين هاي سلولي ماهي آلوده با پلاسميد ptMTb- phMTIIA – CAT , CAT براي مدت 48 ساعت قبل از برداشت، تحت اثر ZnCI2 يا CdCI2 قرار داده شدند. سنجش CAT بر طبق روش فريدين ريچ (Friedenreich) در سال 1990 انجام شده كه در آن فعاليت پروموتر به وسيله درصد تبديل CAT با مقايسه استيل كلرامفنيل (3-Ac) و كلرامفتيكل (Cm) به شرح زير تعيين شد.

پروموتر tMTb در تمام لاين هاي سلولي به جز لاين سلولي PSM فعال بوده است. بنابراين القاء ناشي از فلزات بر روي پروموتر tMTb بستگي به منشاء سلولها و نوع آنها دارد علاوه بر اين در بين چهارلاين سلولي بيشترين القاء در فعاليت پروموتر در لاين سلولي RTH بوده است و لاينهاي A2 , EPC در مراتب بعد قرار داشتند. اين نتايج در كنار اين حقيقت كه در مهره داران سنتز عمده متالوتيونين در كبد اتفاق ميافتد نشانگر اين است كه، اين تكنيك ميتواند روشي براي ابزار ژن متاتيونين در ساير انواع سلولها باشد. همچنين پلاسميد tMTb= CAT‍‍‍‍ ‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍p را به سيتوپلاسم يكي از دو سلول مرحله جنيني ماهي مدوكا از طريق ميكرواينجكش تزريق كردند و مشاهده شد كه ژن CAT در

تعداد محدودي از جنين ها براز شده است. تحقيقات هونگ و همكاران نشان داد كه، پروموتر ماهي در سلولهاي ماهي كارايي بيشتري از ساير سلولها نظير انسان داشته استم. محدوديتهاي زيادي در استفاده از پروموترهاي چند گانه غير متجانس (Heterologous) براي مطالعات ابزار ژن در شرايط زيستي و آزمايشگاهي در زمينه توليد ماهيان ترانسژنيك وجود دارد. با توجه به اينكه پروموتر tMTb نقش غير محسوسي در بيان ذاتي ژن داشته است طوري كه تحت اثر فلزات سنگين القاء شده و سبب ابزار ژن گزارشگر مي شود. اين پروموتر، براي ايجاد ماهيان ترانسژنيك با ژن ساختماني شناخته شده و فهم عمل ژنهاي جديد مناسب است.

2-1- بيان ژن هورمون رشد ماهي در باكتريچ
هورمون رشد يك پلي پپتيد تك زنجيره است كه به وسيله هيپوفيز پيشين توليد و ترشح مي شود. در مهره داران اولين نقش هورمون رشد افزايش رشد سوماتيكي است علاوه بر اين ماهيان استخواني اين هورمون در تنظيم شرايط اسمزي و تعادل الكتروليتي بدن و چندين عمل متابوليكي ديگر نقش دارد. ساختار ژن هورمون رشد و بيان آن، از مدلهاي مهم براي مطالعه رابطه سا ختمان و عمل پروتئين و تنظيم بيان ژن است، طي تحقيقي كه سال 1993 توسط سونگ (Song) و همكارانش انجام شد جداسازي

ژن هورمون رشد و توليد پلي پپتيد آن به ميزان بسيار زياد در ميكروارگانيسم ها بررسي شد. در سالهاي اخير در بسياري از ماهيان اين ژن از طريق cDNA كلون شده است. از جمله در يكي از فعاليتهاي تحقيقاتي ژن هورمون رشد ماهي آزاد چنوك (Chinook salmon) از اين طريق جدا و به باكتري اشيرشياكلي تزريق شده است (Song 1993) در اين تكنيك ابتدا cDNA هورمون رشد و جدا و كلون شد. cDNA 2/1 كيلو جفت باز بوده و در ساختار pSGH4 طراحي شد. سپس دو تا پروب اليگونكلئوتيدي و پرايمر برا‌ي آن ساخته شد.

طراحي پروبها و پرايمرها بر اساس رديف اسيدهاي امينه به روش باندهاي فسفر دي استري روي فاز جامد انجام گرفت. پروب A بر اساس رديف رزيدوهاي 7-1 و پرب B بر اساس رزيدوهاي 172-166 طراحي شدند و به وسيله الكتروفورز روي ژل اكريل آميد خالص گرديدند. همچنين طراحي پرايمرهاي 1و2 بر اساس الگوي cDNA انجام شد. سپس آمپلي فيكاسيون ژن هورمون رشد به وسيله PCR انجام و محصولات PCR به وسيله الكتروفورز روي ژل آگاروز چك و با اتانل رسوب داده شدند و در قدم بعدي پلاسميد لازم براي بيان ژن طراحي گرديد. و ژن مديفاي شده cDNA هورمون رشد به وسيه آنزيمهاي برش دهنده Bam HI , Eco RI برش به ناقل پلاسميدي كه آن هم به وسيله همين آنزيمها برش شده بود منتقل شد.

سپس پلاسميد طراحي شده به باكتري Ecoli JM105 وارد گريدند نو تركيب به وسيله پروب نشانه گذاري شده A مشخص شدند. كلونهاي كه ژن به آ‌نها وارد شده بود. به نام pmAK5 ناميده شدند. اگر چه جهت تأئيد بيشتر مجدد اين كلونها تحت اثر آنزيمهاي برش دهنده قرار داده شدند و با پروب نشانه B هيربد شدند. سپس اشيرشيا كولي هاي Ecoli K12 – JM105 حاوي پلاسميد pmAK5 كه داراي ژن هورمون رشد بودند در محيط كشت YT كلون شدند. پس از انكوباسيون باكتريها با ايزوپروپيل دي تيوگالاكتو پيرانوزيد (IPTG) براي مدت 4 ساعت در دماي 37 درجه، سلولها جدا و در بافر لايملي (Laemmli 1971) حل و با SDS-PAGE و كماسي بررسي شدند. نتايج نشان داد كه به طور تخمين ميزان 10-6 درصد از مجموع تمام پروتئين سلولي در اشيرشياكولي مربوط به ژن هومون رشد بوده است.

3-1- انتقال ژن به تخم ماهي از طريق ميكروپيل با ميكروپيپت
در سال 1998 بريم و همكاران در تحيقيقي ژن هورمون رشد انسان را از طريق ميكروپيل به صفحه زاياي ماهيان تيلاپيا انتقال دادند رشد ماهيان طي 90 روز بررسي شد. جهت تكثير، تعداد 4 يا 5 ماهي ماده را در كنار يك ماهي نر قرار دادند به طوريكه در شرايط آ‌زمايشگاهي تخمك گذاري ماهيان ماده انجام و با اسپرم لقاح شدند. تخم هاي لقاح يافته 10 دقيه پس از تخمك گذاري در شرايط مصنوعي برداشته شدند. تمام تخم ها به انكو باتورهاي ويژه با جريان آب و دماي منتقل شدند و تا زمان دست كاري نگهداري گرديدند. تزريق به تخم ها در زمانهاي 10 دقيقه و 24-21 و 43-40 ساعت پس از تخمك گذاري انجام شد. ساختار پلاسميدي كه در انتقال ژن به تيلاپيا به كار

گرفته شد بنام 1- pXGH در تصوير 4 نشان شده است. اين پلاسميد داراي 31/9 كيلوباز شامل 35/2 كيلو باز از قطعه اي از BPV-1 كه داراي دو محل ويژه برش توسط آنزيمهاي EcoRI , Bam H1 مي باشد. تصوير 4- ساختمان پلاسميد pXGH-1 و جايگاههاي مورد شناسايي آنزيمهاي برش دهنده از طرف ديگر 46/2 كيلو باز آن از قطعه اي از پلاسميد pBR322 و 4 كيلو باز آن كه داراي دو محل ويژه برش توسط Eco RI در دو انتهاي خود مي باشد مربوط به پروموترمتالوتيونين موش mMTI و ژن هورمون رشد انسان ‌hGH كه به آن متصل كرده اند بوده است. اگر چه از اين مقدار 8/1 كيلو باز آن مربوط به پروموترژن متالوتيونين موش و 7/1 كيلو باز آن مربوط به ژن ساختماني

هورمون رشد انسان بوده است. در ژن هورمون رشد نواحي اگزون و انترون و ترتيبات غير قابل ترجه در طراحي شده بود همچنين در سمت ژن هورمون رشد انسان قطعه اي به اندازه 5/0 كيلو از فاژ طراحي شده كه داراي محلهاي ويژه اي جهت برش توسط آنزيمهاي برش دهنده بوده است. علاوه بر اين براي قطعه اي از ژن hGH كه در اثر برش توسط دو آنزيم Bg1 II , Pvn II ايجاد مي شود پروب طراحي شده بود تزريق در يك پتري ديش پر از آب به كمك استريوميكروسكوپ (Wild M8) و دو پيپت انجام شد. تخم ها به كمك يك ميكروپيپت نگهدارنده كه سر آن به شكل فنجان طراحي شده بود مكش و تثبيت و از حركت آنها به طرفين جلوگيري شد. سپس به كمك ميكروپيپت دوم به قطر 5 ميكرومتر محلول حاوي DNA از طريق ميكروپيل به صفحه زاياي تخم ها تزريق شد. مقدار تقريبي 106 كپي از DNA به كمك فشار هوا به هر تخم تزريق شده است. جزئيات تزريق و هچ تا مرحله 90 روز در جدول شماره 2 ذكر شده است.

جدول 2- تعداد تخمهاي مورد تزريق، هچ شده و ما هيان پس از 90 روز
Number of in
Jected fish (n)
Surviving to 90
Days of age (n) Hatching rate of in
Jected eggs (controls) Hatched Injected Time of injection
(after spawning)
5(25%)
18(51%)
44(98%)

67(67%) 66%
77%
90%

(75%) 20
35
45

100 30
45
50

125 10 min
21-24 h
40-43 h
در پايان 90روز از تعداد 18 ماهي باقي مانده از تخم هايي كه در فاصله زماني 24-20 ساعت پس از تخم ريزي مورد تزريق قرار گرفته بودند فقط 3 تا از ماهيان سكانس ژن هورمون رشد را دارا بودند. يك قطعه از 44 ماهي باقي مانده از تخم هايي كه در فاصله زماني 43-40 ساعت پس از تخم ريزي مورد تزريق قرار داده شده بودند، ترانسژنيك شده و سكانس ژن را داشته است. تيلاپيا از جمله ما هياني است كه داراي كوريون سفت مي باشد. به طوري كه نمي توان كوريون آن را به راحتي با ميكروپيپت سوراخ

كرد بنابراين نياز به دستكاريهاي ديگر مي باشد. ساده ترين و ضروري ترين راه غلبه برسد كوريون، تزريق از راه ميكروپيل است كه اين خود مستلزم نگهداري و تثبيت تخم مي باشد. تخم را بايد تا زماني در زير استريوميكروسكوپ چرخاند تا ميكروپيل آن قابل روئيت شود. گاهي در يك آزمايش چندين تكرار لازم است تا ميكروپيپت از راه مركز ميكروپيل وارد شود. اگر چه در اين تحقيق كه مورد دستكاري قرار داده شده اند در مقايسه با شاهد يكسان بوده است.
4-1- انتقال ژن از طريق اسپرم با انكوبه كردن آن در سيستم بافري

كهو (khoo) و همكاران در سال 1992 گزارشي در خصوص ورود ژن خارجي از طريق اسپرماهي زبرا و بررسي اينكه آيا اين ژن به نسل هاي بعد منتقل مي شود ارائه كردند. در اين تحقيق اسپرم را از ماهيان بالغ به دست آودره و آن را در محلول حاوي پلاسميد نو تركيب كه داراي ژن گزارشگر مورد علاقه بود انكوبه كردند. سپس اين اسپرم براي لقاح تخمكهاي ماده مورد استفاده قرار داده شد. جنين هايي به دست آمده حاصل از لقاح اسپرم حاوي ژن خارجي و تخمك تا مرحله بلوغ مراقبت شدند همچنين ژنوميك DNA آنها استخراج و بررسي حضور ژن خارجي منتقل شده با تكنيك ساترن بلوت انجام شد ژن گزارشگر مورد علاقه در اين تحقيق مشابه پلاسمي

د استفاده شده توسط جونگ (Chong) در سال 1989 پلاسميد pUSV – CAT بوده است. ساختمان اين پلاسميد در تصوير5 ديده مي شود ژن گزارشگر كرامفنتيل استيل ترانسفراز (CAT) انتخاب شد. زيرا محصول اين ژن به سرعت و به سادگي مورد آزمايش قرار مي گيرد و علاوه بر اين آنزيمي مشابه اين در سيستم آنزيمي يوكاريوتها وجود ندارد. پلاسميد PUSV – CAT داراي ترتيبات تكراري براي اتمام از ويروس روزساكروما Rous sarcoma و پروموتر ويروس SV40 در شروع بوده است. مزيت استفاده از ماهيان زبرا جهت اين آزمايشات به دليل دوره كوتاه ايجاد نسل در آنها مي باشد. به طوريكه تخم ها در عرض 3 تا 4 روز هچ مي شوند و در فاصله زماني 3 تا 4 ماه ماهيان بالغ مي گردند. همچنين توليد ماهيان و نگهداري و مراقبت از لارو آنها در شرايط آزمايشگاهي امكان پذير است. لقاح تخمك هاي ماهي زبرا با سلولهاي اسپرم كه در معرض

پلاسميد نوتركيب قرار گرفته بودند انجام شد. جهت دست آوردن اسپرم نرهاي بالغ به اندازه 4-3 سانتي متر و سن 4-3 ماه را تشريح كردند. سپس بيضه ها را جدا كرده و در 100 ميكروليتر بافر PBS قرار دادند. آنگاه آنها را در يك كاغذ پارافين قرار داده و به آرامي خرد كردند. سوسپانسيون هموژن تهيه شده از بيضه هاي را به اپندروفهاي 5/1 ميلي ليتري منتقل كردند. تكه هاي بافتي به وسيله سانتريفوژ با دور ‌g800 براي مدت يك دقيقه، در دماي اطاق جدا كردند. سپس محلول رويي را به اپندروفهاي استريل ديگر منتقل كردند. به محلول رويي حاوي اسپرم 900 ميكروليتر از بافر PBS اضافه نمودند. در ادامه پس آنها را به مدت 3 دقيقه با دور 4000 سانتريفوژ كرده و محلول رويي را مجدداً جدا نمودند. اين فرآيند را دو مرحله تكرار كردند. پس از شستشوي نهايي اسپرمها را در سپانسيون 25 ميكروليتري از بافر قرار دادند. به اين سوسپانسيون آماده

پلاسميد pUSV-CAT كه به فرمهاي خطي و حلقوي بود اضافه شد. پس از مخلوط كردن براي اين مدت 30 تا 40 دقيقه در دماي 22 درجه سانتي گراد انكوبه گرديدند. سپس تخمكهاي رسيده را از ماهيان ماده به دست آورده، در يك پتري ديش به دو قسمت مساوي تقسيم كردند، يك قسمت به آرامي با 25 ميكروليتر از سوسپانسيون حاوي اسپرم كه با يلاسميدانكوبه شده بود و نصف ديگر آن را با اسپرم شاهد كه تحت تيمارپلاسميد قرار نگرفته بود لقاح دادند. به كمك نمونه برداري از لاروها خا در سن يك هفتگي و برش باله سينه اي از ماهيان بالغ DNA استخراج و بررسي به روش ساترن بلوتينگ روي DNA با كلرامفنيل نشانه دار به عنوان سربستر انكو به شود فرم

استيله شده آن توليد خواهد شد كه پس از جدا سازي بوسيله كروماتوگرافي قابل تشخيص است. نتايج نشان داد كه، پلاسميد حاوي ژن گزارشگر CAT در ماهيان و زاده هاي نسل بعد آن ظاهر مي شود. سنجش آنزيمي CAT روي ماهيان و زاده ها نشانگر عدم ابرازژن به پلي پيتيد بوده است. از طرف ديگر استيورات (Stuort) و همكاران در سال 1990 روش ميكرواينجكشن را با همين پلاسميد بر روي همين گونه ماهي به كار گرفتند در اين تحقيق ابرازژن به پلي پييتيد صورت گرفت بنابراين عدم بيان ژن به

علت خصوصيات ذاتي ماهيان يا عدم شركت پروموتريلاسميد در رونويسي نمي باشد، اغلب باشد ممكن است ژني كه با استفاده از ناقل اسپرم وارد مي شود تغيير كرده و ترتيب جديدي پيدا نمايد به طوري كه ژن بيان نشود. اين اختلاف در ابرازژن وابسته به دقايقي است كه در مقدمه ژن خارجي (پروماتور) صورت مي گيرد در ميكرواينجكشن استيورات، DNA پلاسميد در مرحله ميتوز به ميزبان معرفي شده است. تعداد ديگر از محققان با به كارگيري پلاسميدها و كار روي ساير ماهيان نيز عدم بيان ژن را گزارش كرده اند. يكي از دلايل عدم بيان ژن ناشي از اين است كه، پروموترو اينهنسر مورد استفاده در ماهي به عنوان نواحي شروع شناخته نمي شوند. به نظر نمي رسد كه شكل خطي بودن يا حلقوي بودن DNA براي انتقال آميز ژن در ماهي تأثيري داشته باشد بلكه هر دو شكل DNA اثرات مشابهي از خود نشان مي دهند.

تصوير 5- دياگرام پلاسميد pUSV-CAT در آن قطعه RSV LTR , CAT و نواحي پروموتر و اينهسنر SV40 نشان داده شده است جايگاه برش توسط آنزيمهاي برش دهنده شامل (Kpn I) K , (Ps II) P , (Sal I)S مي با شد در اثر برش توسط آنزيم Ps II دو قطعه 63/4 و 24/3 كيلو جفت بازي ايجاد مي شود.
5-1- انتقال ژن از طريق اسپرم با الكتروپورشن در سيستم بافري
در سال 1993 سين (Sin) و همكاران انتقال ژن به ما هي آزاد چنوك را از طريق اسپرم به كمك الكتروپورشن انجام دادند. براي اين منظور از پلاسميد pRSV-LacZ استفاده كردند (تصوير 6) اين پلاسميد آن LacZ و ناحيه اتمام

(Rous sarcama virus) RSV و قطعه اي از ژن SV40 و دو ناحيه برش توسط آنزيمهاي Pst I , Hind III داشته است. سلولهاي اسپرم جهت الكتروپورشن در شرايط دماي سرد ناشي از آب يخ در طي آزمايش نگهداري شند. حدود نيم ميلي ليتر اسپرم با نيم ميلي ليتر از باز HEPES حاوي 10 ميكروگرم پلاسميد مخلوط كرده و آنها را در معرض پالس ميدان الكتريكي با قدرت هاي متفاوت قرار دادن جزيئات نتايج در جدول شماره 3 بيان شده است.

نتايج نشان داد، كه در قدرت ميدان 625 ولت بر سانتي متر و پالس 6/18 ميلي ثانيه است نسبت ماهياني كه پلاسميد را دريافت داشتند 2 به 20 بوده است. همچنين در قدرت ميدان 1150 و پالس 6/18 اين نسبت 1 به 20 بوده است. اگر اسپرم داراي تحريك پذيري (Motility) باشد خواهد توانست غشاء سيتوپلاسمي تخمك ارتباط برقرار كرده و به آن نفوذ نمايد. بنابراين سنجش تحريك پذيري اسپرم شاخص مناسبي جهت تشخيص توانايي آن در لقاح است. اين تحريك پذيري ممكن است تحت تأثير رقيق كننده ها قرار گيرد. بيلارد (Billard) در سال 1993 نشان داد كه، رقيق كردن اسپرمها به نسبت به 1 به 100 براي داشتن 100 درصد اسپرم با تحريك پذيري مناسب جهت القاح لازم مي باشد. با اين وجود رقت انجام شده در اين تحقيق به نسبت 1 به 1 شايد تخمين مناسبي نبوده است. از طرف ديگر موقعي كه ميدان قوي تر يا پالس

طولاني تر شود تحريك پذيري اسپرم كاهش مي يابد. عين همين مسئله در زمينه الكتروپورشن روي كشت هاي سلولي گزارش شده است. همچنين قدرت يوني بافر هم روي توانايي زيست اسپرم مؤثر است. در اين تحقيق اختلاف معني داري بين ميزان بافي ماندگي تخم هايي كه تحت اثر ميدان الكتريكي و پالس هاي مختلف قرار گرفته بودند با تخم هايي كه تحت سيستم بافري بدون پالس قرار داده شدند مشاهده نشده است. بلكه از نظر باقي ماندگي مشابه بوده اند. همچنين رشد جنيني در تخم هايي كه تحت تميار بافري قرار داده نشدند با تخم هايي كه تحت تميار بافري قرار گرفته بودند و تخم هايي كه تحت الكتروپورشن بوند يكسان بوده است. اختلافي كه در نتايج الكتروپورشن با اسپرم گون هاي مختلف است. كارايي ميزان ورود پلاسميد به سلول گيرنده در الكتروپورشن به نوع سلول پارامترهاي مختلف ديگري بستگي دارد.

سين و همكاران گزارش كردند كه ، در خصوص ورود يا عدم ورود DNA پلاسميد به ميزبان اطلاعي ندارند اگر چه باندي از DNA پلاسميد با DNA ميزبان را مشاهده كرند. ولي در عين حال باندهايي از DNA با وزن ملوكولي كم را هم مشاهده كردند. نظير اين پديده روي ماهي لوچن توسط كوزلو (Kozlov) در سال 1989 گزارش شده است. علاوه بر اين در ماهي قزل آلاي 6 تا 12 ماه پلاسميد خارج كروموزومي گزارش شده است. اگر چه كهو در سال 1992 از پلاسميد خطي و حلقوي استفاده كرد و گزارش كرد كه هر دوي اينها خارج كروزومي هستند جانگ (Chong) در سال 1989 DNA پلاسميدهاي خطي و سوپر كويل را به تخم هاي لقاح يافته مدوكا تزريق كرد و مشاهده

كرد كه DNA پلاسميد خطي پس از 5 دقيقه به صورت به هم پيوسته مي شود. از طرف ديگر زماني كه DNA سوپر كويل را تزريق كرد مشاهده كرد DNA پلاسميدي در سه فرم سوپر كويل و حلقوي با يك شكست و واحدهاي متعدد حلقوي وجود دارد.