بخشی از مقاله
زنگ قهوهاي بوسیله قارچ Puccinia triticina ایجاد میشود و یکی از بیماريهاي مهم گندم در سطح جهان است که اپیدمی آن منجر به کاهش شدید عملکرد و کیفیت گندم نان میشود . در این مطالعه تغییرات ساختاري و تنوع نوکلئوتیدي برخی از ژنهاي مقاومت به زنگ قهوهاي در هفت ژنوتیپ گندم نان با درجات متفاوت مقاومت بررسی شد. ژنهاي مقاومت به زنگ قهوهاي و یا نواحی پیوسته با این ژنها با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی طراحی شده بر اساس توالیهاي موجود در بانک هاي اطلاعاتی تکثیر شدند. قطعات تکثیري در باکتري E. coli همسانهسازي و توالییابی شدند. همردیف کردن توالی ژنهاي جداسازي شده با توالیهاي موجود در بانکهاي اطلاعاتی NCBI، شباهت بالاي آنها را با توالی ژنهاي مقاومت از جمله ژن هاي NBS-LRR و RGAها نشان داد.
ژنهاي Lr35، Lr1 و Lr21 با ژنهاي مربوطه از NCBI همردیف شدند. قطعات ژن هاي Lr47 و Lr51 به ترتیب با ژن ساکارز سنتاز نوع I و agp2، شباهت داشتند. ژنهاي Lr29 و Lr10 بترتیب با ژنهاي ACC-1و توالیهاي ریزماهواره شباهت نشان دادند. بین ژن Lr39 وتوالی ژن VRN1 که مسئول بهارهسازي در گندم زمستانه است، شباهت 88 درصد وجود داشت. نتایج بدست آمده از همردیف کردن توالیها و گروه بندي آنها، حاکی از وجود تغییرات ساختاري و تنوع نوکلئوتیدي در بین ارقام بود. برخی از توالیها در بعضی از ژنها فقط از نظر چند نوکلئوتید در بین ارقام تفاوت نشان دادند که میتوان از آن ها براي طراحی آغازگرهاي اختصاصی مبتنی بر SNPها جهت شناسایی ارقام حساس و مقاوم استفاده کرد.
کلمات کلیدي: گندم نان، ژنهاي مقاومت به بیماري
مقدمه
زنگ قهوهاي گندم یکی از بیماريهاي قارچی مهم گندم است که بیشترین پراکنش را در سطح جهان دارد و تولید گندم را تحت تاثیر قرار میدهد . - 11 - در حال حاضر بیش از 50 ژن مقاومت به زنگ قهوهاي در ژرم پلاسمهاي گندم و گونههاي خویشاوند آن شناسایی شده است و تعداد زیادي از آنها در برنامههاي اصلاحی گندم استفاده میشوند . - 5 - از بین این ژنها تاکنون 46 ژن مقاومت به زنگ قهوهاي در کروموزومها مکانیابی شدهاند و به نامهايLr51 – Lr1 شمارهگذاري گردیدهاند . - 9 - سه ژن Lr1، Lr10 و Lr21 از گندم هگزاپلوئید جداسازي و همسانه شدهاند 3 - ، 5، . - 8 همچنین هلگوئرا و همکاران - 7 - قطعات 790 و 800 جفتبازي از ژن Lr51، راپ و همکاران - 12 - با استفاده از آغازگرهاي ریزماهواره GWM296 و GWM210 بترتیب قطعاتی بطول 145 و 190 جفت باز از ژن Lr39 در ژرم پلاسمهاي مقاوم و در نمونه TA1675 از Ae. tauschii تکثیر کردند.
هلگوئرا و همکاران - 6 - قطعهاي به طول 380 جفتبازي براي ژن Lr47 در گندم نان تکثیر کردند که با ژن ساکارز سنتاز نوع یک و دو شباهت بیشتري داشت. سیفراث و همکاران - 15 - از دو جفت آغازگر براي تکثیر ژن Lr35استفاده کردند و با طراحی آغازگر اختصاصی قطعه 931 جفت بازي در لاین مقاوم THLr35 تکثیر شد. هدف این بررسی شناسایی، همسانهکردن و توالییابی تعدادي از ژنهاي مقاومت به زنگ قهوهاي یا نواحی ژنومی حامل آنها در هفت رقم گندم نان با درجات متفاوت مقاومت به زنگ بود.
مواد و روشها
مواد گیاهی شامل هفت ژنوتیپ گندم نان با درجات متفاوت مقاومت به زنگ قهوهاي در مرحله گیاهچه و گیاه کامل بودند که از موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر کشور تهیه شدند. پاسخ به زنگ این ژنوتیپها براساس مطالعات مختلف در بخش غلات، موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر تعیین گردیده است. استخراج DNA ژنومی با روش - 14 - CTAB انجام و کمیت و کیفیت نمونه هاي DNA با استفاده از اسپکتروفتومتر و الکتروفورز ژل آگارز 0/8 درصد تعیین شد. براي تکثیر ژنهاي مقاومت به زنگ قهوهاي یا نواحی پیوسته با آنها، از آغازگرهاي طراحی شده براساس اطلاعات موجود در NCBI استفاده شد.
واکنش زنجیرهاي پلیمراز در حجم نهایی 10µl و با استفاده از پروتکل سمیت - - 2 انجام و قطعات تکثیري از ژل جداسازي و به ناقل pTZ57RT الحاق و در باکتري E. coli سویه DH5α همسانه شدند. غربال کلنیها انجام و کلنیهاي سفید رنگ حاوي قطعات تکثیري براي استخراج پلاسمید انتخاب شدند. تهیه سلولهاي مستعد با استفاده از روش کوهن وهمکاران - 4 - انجام شد. استخراج پلاسمید با استفاده از روش پیشنهادي برینبوئیم و دالی - - 1 انجام و قطعات براي توالییابی به شرکت ماکروژن کرهجنوبی ارسال شدند. همردیف کردن توالیها با استفاده از الگوریتم همردیفی چندگانه کلاستال w صورت گرفت. بررسی وجود چندشکلی ها، با استفاده از برنامه - 13 - Dnasp ver3.0، برآورد گردید. براي گروهبندي ارقام از الگوریتم Neighbor- joining در برنامه - 10 - MEGA4.0 استفاده شد.
نتایج و بحث
با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی قطعاتی از این ژنها تکثیر شد که در شکل 1 و 2 مشاهده میشود. همردیف کردن توالی ژنهاي جداسازي شده با توالیهاي موجود در بانکهاي اطلاعاتی NCBI، شباهت بالاي آنها را با توالی ژنهاي مقاومت از جمله ژنهاي NBS-LRR و RGAها نشان داد. ژنهاي Lr35، Lr1 و Lr21 با ژنهاي مربوطه از NCBI همردیف شدند. قطعات ژن Lr1 با توالی ژن Lr1 موجود در NCBI در رقم Glenlea شباهت 100 درصد و با ژن Lr34 شباهت 88 درصد نشان داد که میتواند نشان دهنده شباهت ساختاري این دو ژن باهم باشد . ژن Lr21 با توالی مربوط به الل نوترکیب S ژن Lr21 موجود در NCBI شباهت 100 درصد و با الل S شباهت 98 درصد و با سایر پروتئینهاي مقاومت Lr21 شباهت 99 درصد نشان داد.
ژن Lr35 با توالی مرتبط با این ژن در NCBI و با ژن Lr21 شباهت 93 درصد داشت. همچنین این ژن با مکان ژنی مقاومت به سفیدك پودري و تحمل به سرمازدگی در گندم، 84 درصد همولوژي نشان داد.شکلa -1، الگوي نواري پلاسمیدهاي برشیافته با آنزیمهاي EcoRI و .HindIII حاصل از تکثیر ژن .Lr21پلاسمید با طول 2886 جفتباز و قطعه درجی با طول 1442 جفتباز، 244 جفت باز حاصل از تکثیر ژن - b - Lr1 و 351 جفت باز حاصل از تکثیر - c1-c3 - Lr35 قبل و بعد از برش آنزیمی. اندازه نوارها با استفاده از نشانگر100 جفتباز نشان داده شده است.بلاست قطعات ژنهاي Lr47 - بطول 396 جفت باز - و Lr51 - بطول 788 جفت باز - به ترتیب با ژن ساکارز سنتاز نوع I و agp2 که زیر واحد بزرگ -ADP گلوکز پیروفسفوریلاز را رمزمیکند، شباهت داشتند.
ژنهاي Lr29 و Lr10 بهمراه Lr50 - شکل - 3c بترتیب باژنهايACC-1 وتوالی هاي ریزماهواره شباهت نشان دادند. همچنین ژن - Lr39 بطول 269 جفت باز، شکل - 2b با ژن Lr1 داراي شباهت بود که میتواند نشاندهنده شباهت ساختاري این ژنها باشد. بین این ژن و توالی ژن VRN1 که مسئول بهارهسازي در گندم زمستانه است، شباهت 88 درصد وجود داشت.شکل 2 الگوي نواري پلاسمیدهاي برشیافته با آنزیمهاي EcoRI و .HindIII پلاسمید با طول 2886 جفتباز و قطعه درجی با طول 396 جفتباز حاصل از تکثیر ژن Lr47 و 269 جفت باز حاصل از تکثیر ژن .Lr39 اندازه نوارها بر اساس نشانگر 100 جفتباز نشان داده شده است.
نتایج بدست آمده از همردیف کردن توالیها و گروه بندي آنها، حاکی از وجود تغییرات ساختاري و تنوع نوکلئوتیدي در بین ارقام بود - شکل . - 3 برخی از توالیها در بعضی از ژنها فقط از نظر چند نوکلئوتید در بین ارقام تفاوت نشان دادند ولی توالیهایی نیز وجود داشتند که تفاوت بالایی داشتند. این تفاوت بالااحتمالاً میتواند بدلیل وجود توالیهاي تکراري و ترانسپوزونها باشد.شکل -3 هم ردیفی توالی 244، 396و 158 جفت بازي بترتیب از ژنهاي Lr1 ، Lr47 و Lr50 تکثیر شده با استفاده از جفت آغازگر Lr1-2، pCaps، ps10L و Gdm87 در هفت ژنوتیپ گندم نان. جایگاههاي چندشکل با رنگ متفاوت در مقایسه با جایگاههاي تک شکل نشان داده شدهاند.
