بخشی از مقاله
چکیده
تکنولوژي هیبرید در افزایش عملکرد برنج بسیار موفقیت آمیز می باشد. در این مطالعه تجزیه ژنتیکی ژن هاي برگرداننده باروري با استفاده از نشانگرهاي STS همبسته با ژن باروري در جمغیت F2 حاصل از گیاهان والدینی - IR58025A - و آمل- 2 در گیاه برنج مورد مطالعه قرار گرفت. این مطالعه در دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبیعی ساري در آزمایشگاه بیوتکنولوژي در سال 1389 انجام گرفت. والدین و نمونه گیاهان جمعیت F2 مورد بررسی فنوتیپی و ژنوتیپی قرار گرفتند.
میزان باروري دانه گرده گیاهان با استفاده از I2-KI مورد مطالعه قرار گرفت. ارزیابی فنوتیپی دانه گرده نسبت - عقیم 15 :1 بارور - را نشان داده که بیانگر وجود دو ژن برگرداننده باروري در رقم آمل 2 – می باشد همچنین بررسی ژنتیکی ژن هاي برگرداننده باروري نشان داد که نشانگر مولکولی S10019 همبسته با ژن Rf4 روي کروموزوم 10، بین والدین چند شکلی نشان نداده ولی نشانگر مولکولی RG140 همبسته با ژن Rf3 روي کروموزوم 1، چند شکلی بین والدین نشان داده است ارزیابی ژنوتیپی جمعیت F2 با استفاده از نشانگر مولکولی RG140 نشان داد این نشانگر حدود 13 سانتی مورگان با ژن برگرداننده باروري مورد نظر فاصله داشته است.
مقدمه
برنج غذاي مهم براي بیش از نیمی از مردم جهان است. الوي و همکاران - 2009 - فاصله ژن Rf3 را از نشانگرهاي RM323، RM3873، RM1 و نشانگر - RG140/EcorI - CAPS در 91 گیاه حاصل از جمعیت - Neda-A × IR36 - F2 مطالعه کرده و اظهار داشتند که ژن Rf3 در فاصله 6/5 سانتی مورگان با نشانگر RM1 و 12/5 سانتی مورگان با نشانگر RG140 و 15/8 سانتی مورگان با نشانگر RM3873 و همچنین 17 سانتی مورگان با نشانگر RM323 قرار دارد.
احمدي خواه و همکاران - 2007 - گزارش دادند که در WA- CMS، نشانگر RM1 با ژن Rf3 روي بازوي کوتاه کروموزوم 1 و نشانگر RM171 با ژن Rf4 روي بازوي بلند کروموزوم 10 پیوسته اند. ستاري و همکاران - 2007 - ژن Rf1 برگرداننده باروري سیستم CMS - BT را با استفاده از نشانگرهاي C1361 و S10019 به ترتیب 0/2 و 0/8 سانتی مورگان روي کروموزوم 10 مکان یابی کردند.
مطالعات اخیر نشان دادند که Rf4 براي سیستم CMS-WA با نشانگر 1/6 - RM1108 سانتی مورگان - روي کروموزوم 10 پیوسته می باشد - . - 10 یائو و همکاران - 1997 - ژن Rf4 را بین نشانگرهاي G4003 و C234 و بین نشانگرهاي C1361 و S10019 مکان یابی نمودند. ستاري و همکاران - 2008 - در سیستم CMS-WA فاصله Rf3 را از نشانگر RM490 ، 2/8 سانتی مورگان و فاصله Rf4 را از نشانگر RM1108 روي کروموزوم 10 به فاصله 1/6 سانتی مورگان مشخص کردند. هدف از این مطالعه ارزیابی ژنتیکی ژن هاي برگرداننده باروري در رقم آمل- 2 براي نرعقیمی سیتوپلاسمی نوع WA در برنج از طریق مطالعه فنوتیپی و مولکولی بوده است.
مواد و روشها
ژنوتیپ هاي مورد استفاده در این مطالعه شامل لاین نرعقیم سیتوپلاسمی - IR58025A - که این لاین از منبع سیتوپلاسمی نوع WA - Wild abortive - می باشد و لاین برگرداننده باروري به نام آمل- 2 می باشد، که در طرح تحقیقاتی تولید برنج هیبرید مورد استفاده قرار می گیرند
درصد باروري دانه گرده و میزان تشکیل بذر به عنوان معیارهاي مهم براي ارزیابی گیاهان بارور و عقیم مورد استفاده قرار گرفتند. براي ارزیابی باروري دانه گرده، گلچه ها از خوشه مربوط به پنجه هاي اصلی تهیه شدند. سه گلچه به طور تصادفی از قسمت هاي مختلف روي هر خوشه انتخاب و بساك هاي هر گلچه در محلول یک درصد - I2-IK - روي لام به طور جداگانه له شده و میزان باروري با استفاده از میکروسکوپ مورد مشاهده قرار گرفت.
گیاهان به گروه هاي مختلف بارور بر اساس نسبت دانه هاي رنگ گرفته و تعداد دانه گرده بارور به تعداد کل دانه گرده مشاهده شده ضرب در صد طبقه بندي شدند. با توجه به درصد باروري دانه گرده، گیاهان نسل F2 به کلاس هاي زیر طبقه بندي شدند؛ گیاهان F2کاملاً عقیم - <5 درصد باروري - ، جزئی عقیم 49 -5 - درصد باروري - ، جزئی بارور 86 -50 - درصد باروري - و > 86 - درصد باروري - کاملاً بارور تقسیم شدند.شایستگی نسبت الگوي تفکیک گیاهان بارور، نیمه بارور، نیمه عقیم و کاملاً عقیم در گیاه F2 با استفاده از آزمون کاي اسکور مورد بررسی قرار گرفت. همچنین زمانی که گیاهان در مرحله 4 برگی بودند از گیاهان نمونه برگی سالم گرفته شد و DNA نمونه ها با استفاده از روش CTAB تغییر یافته استخراج گردید
واکنش زنجیره اي پلیمراز
از آغازگرهاي مورد استفاده در این آزمایش شامل RG140 همبسته با ژن Rf3 روي کروموزوم 1 و S10019 همبسته با ژن Rf4 روي کروموزوم 10 بودند . واکنش زنجیره اي پلیمراز و واکنش هضم آنزیمی طبق روش ستاري انجام گرفت . - 5 - توالی هاي آغازگر s10019 شامل پرایمر پیش رو' - 5'--AACAATCTTATCCTGCACAGACTG-3 و آغازگر عقب رو -3' - - 5'-GTCACTAGAAGCAGATGGGTTCC بوده است. توالی هاي آغازگرRG140 شامل پرایمر پیش رو - 5'-CCTCAGGTATTTTGTTAGCT-3' - و آغازگر عقب رو - 5'-ACACCACCATATGCCCATGC-3' - بوده است
محصول واکنش PCR براي شناسایی لاین عقیم از بارور با آنزیم هاي مربوطه هضم شدند. براي هضم آنزیم نشانگر S10019 از آنزیم BSTU I استفاده گردید و هضم واکنش در دماي 37 درجه سانتی گراد صورت گرفت و نیز براي هضم آنزیمی نشانگر RG140 از آنزیم PVU II استفاده و هضم آنزیمی نیز در دماي 37 درجه سانتی گراد صورت گرفت . - 5 - محصول هضم آنزیمی در ژل آگارز 2 درصد با ولتاژ 60 ران شدند و سپس با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزي شدند. براي تجزیه تک نشانگر، فراوانی نوترکیبی بین نشانگر مثبت و مکان - هاي - Rf از طریق برآورد کننده حداکثر درستنمایی محاسبه خواهد شد
نتایج و بحث
بررسی تفکیک باروري جمعیت F2 - آمل - - IR58025A × 2 از طریق بررسی درصد باروري خوشه نشان داد که 143 گیاه بارور، 61 گیاه نیمه بارور، 55 گیاه نیمه عقیم و 11گیاه کاملاً عقیمبودند که براي فهمیدن چند ژنی بودن از آزمون کاي اسکور استفاده شد. این آزمون نسبت 9 کاملاً - بارور - ; 3 - نیمه بارور - 3 - نیمه عقیم - 1 کاملاً - عقیم - - و یا نسبت : 15 - بارور - : 1 - عقیم - - را براي درصد باروري دانه گرده تأیید کرد - نمودار - 1، همچنین توزیع درصد
باروري خوشه به صورت - بوده که مطابق با تست دانه گرده می باشد - نمودار . - 2 لذا می توان نتیجه
گرفت که صفت برگرداننده باروري در رقم آمل 2 – دو ژنی است و دو ژن غالب و مستقل از هم هستند. توزیع فنوتیپی F2 در شکل زیر نشان داده شده است.
درصد باروري دانه گرده
نمودار -1 توزیع فراوانی درصد باروري دانه گرده در جمعیت F2 حاصل از تلاقی آمل-.IR58025A × 2
از آغازگرهاي STS مورد استفاده S10019 - و - RG140 براي جمعیت F2 حاصل از تلاقی IR58025A و آمل-2، آغازگر S10019 چند شکلی بین والدین نشان نداده است - شکل -1 الف - . در حالیکه آغازگر RG140 چندشکلی بین والدین نشان داده و آزمون کاي اسکور نشان داد که ژن Rf3 و RG140 روي یک کروموزوم بوده و و با هم پیوستگی دارند. نسبت 1:2:1 براي ژن مورد نظر RG140 معنی دار نشده که نشان دهنده هم تفرقی آنهاست و فاصله ژنتیکی نشانگر RG140 با ژن Rf3 به میزان 13سانتی مورگان برآورد شده است.
مارکر S10019 طبق شکل زیر پیش از هضم آنزیمی قطعاتی به طول 600 bp ایجاد کردند
شکل -1 الف - تشکیل باند 600 bp براي نمونه هاي والدین و جمعیت F2 توسط نشانگر S10019 قبل هضم آنزیمی و بعد از هضم آنزیمی لاین نر بارور طول قطعه اي به طول 225 bp و 125 ایجاده کرد.
شکل -1 ب- مارکر -s10019 والدین
نشانگر RG140 در جمعیت مورد بررسی بین والدین چند شکلی نشان داده است و میزان نوترکیبی با این ژن 13 درصد بدست آمده است . ستاري و همکاران - 2008 - نشان دادند که تعیین نشانگر RG140 / PVU II قابل استفاده در غربال براي بازگرداندن باروري در سیتوپلاسم WA می باشد. تعیین نشانگرهاي پیوسته می توانند براي استفاده در MASبه کار روند
