بخشی از مقاله
پايش زيستي هيدروکربن هاي چند حلقه اي آروماتيک (PAH) در دو کف اي Anodont cygnea تالاب انزلي و تعيين کاربرد بيومارکر (NRR) به عنوان شاخص زيستي اين آلاينده ها
چکيده :
علم سم شناسي بيوشيميايي محيط زيست (Biochemical Ecotoxicology) و بکارگيري بيو مارکرها، علوم جواني هستند که شکوفايي آن از دهه ٩٠ ميلادي شروع شده و سبب گرديده تا نسبت به روشهاي شيميايي بسياري از سنجش هاي زيست محيطي امروزي بخصوص در محيط هاي آبي معني دارتر، ارزانتر و بهتر از گذشته انجام شود و نيازي به مراحل نسبتاً طولاني و پيچيده آماده سازي هاي شيميايي نباشد. از سوي ديگر در سالهاي اخير، توجه به آلاينده هايي مثل PAHها بواسطه خصوصيات سرطانزايي اين ترکيبات، افزايش يافته است . تقريبا بسياري از مواد دفع شده در محيط زيست بواسطه آلودگي ترکيبات نفتي يا پسابهاي صنعتي ، حاوي اين آلاينده هاي مي باشند.
در تحقيق حاضر هدف تعيين مقدار PAH ها در دوکفه اي (Anodonta cygnea) و تاثير اين آلاينده ها بر روي سلول هاي همولنف در دو ايستگاه (ماهروزه و سلکه ، در تالاب انزلي در شمال ايران ) و تعيين و معرفي اين دوکفه اي به عنوان بيو مارکر براي آلاينده هاي مذکور است . نمونه برداري در دو دوره زماني متفاوت سال يعني فصل خشک و فصل بارندگي (اواخر خرداد و اواخر شهريور)صورت گرفته است و جهت تاييد نتايج اوليه در يک ايستگاه آلوده، Cage هم گذاشته شده و نمونه هاي آن بررسي شده است . صدمات غشايي سلولهاي همولنف دوکفه اي مذکور با استفاده از روش (neutral red retention assay)NRR مورد بررسي قرار گرفته است .
غلظت PAH ها در بافت دوکفه اي ايستگاههاي مورد نظر توسط روش شيميايي گاز کروماترگرافي طيف سنجي جرمي -GC) (Mass تعيين شده است . ميانگين غلظت PAH ها در دوکفه اي آنودونت ng.g dw ٣٧٣.٧٨٨-١١٥ مي باشد. علائم تخريب سلولي بر طبق روش Lowe ( نظير مرگ سلولها، از دست دادن رنگ سلولهاي رنگ آميزي شده و کاهش ناپايداري غشا و ....) مشاهده شده است .
آناليزهاي آماري انجام شده و همبستگي قوي و معني داري بين غلظت PAH ها و روش NRR گزارش مي شود(٠٠٠٠٥>P).نتايج اين پروژه تحقيقاتي حاکي از مفيد بودن روش بيومارکري پايداري غشاي زيستي همولنف (NRR) در تشخيص محيط هاي آلوده آبي است و براي اولين بار سلولهاي همولنف آنودونت (Anodonta cygnea) بعنوان بيومارکري کارآمد در تعيين آلودگي PAH ها در آبهاي شيرين معرفي مي شود.
کلمات کليدي : تالاب انزلي ، PAH،NRR ، آنودونت ، بيومارکر
مقدمه :
با توجه به اهميت تالاب انزلي بعنوان يک تالاب بين المللي ، همچنين برخورداري شرايط اکوسيستمي اين تالاب براي پرورش و رشد آبزيان در حاشيه جنوبي درياي خزر از يک سو و وجود جايگاه ويژه نرمتنان از سوي ديگر پايش زيستي اين تالاب از اهميت خاصي برخوردار است . متاسفانه تالاب انزلي همواره در معرض تهديد آلاينده هاي نفتي نظير PAHها (با توجه به اکتشافات نفتي اخير در درياي خزر) و پسابهاي شهري قرار دارد.
PAHها به دليل دارا بودن ماهيت ليپوفيل براحتي مي توانند پس از ورود به زنجيره غذايي و بدن موجودات زنده، در بافت هاي چربي ذخيره و علاوه بر تجمع زيستي (Bioaccumlation) در بدن موجودات به دليل سرطانزايي ، خطرات جبران ناپذيري را به بار آورند. با توجه به موارد مذکور، لزوم تعيين غلظت اينگونه آلايندهها در محيط زيست و محيط هاي آبي بسيار حائز اهميت بوده و علاوه بر اينکه سبب مي شود وضعيت آلودگي محيط زيست نسبت به اين آلايندهها در حال حاضر مشخص شود تا اقدامات مناسب مديريتي براي رفع آن انجام پذيرد همچنين مي تواند مبنايي براي مونيتورينگ هاي سالهاي آتي و بررسي روند افزايش احتمالي آنها هم باشد.
از سوي ديگر در دهه هاي اخير بکارگيري بيومارکرها به عنوان روشي جديد براي تعيين اثرات آلاينده ها معرفي شدهاند. يکي از بيومارکرهاي مهم استفاده از بررسي پايداري غشاهاي زيستي است که در اين روش با استفاده از موجودات زنده بومي و داراي فراواني مناسب در محيط ، ميزان آلايندهها مورد بررسي قرار گرفته و تعيين مي گردد.
در اين پروژه دوکفه اي Anodont که بومي تالاب انزلي است مورد بررسي قرار گرفته و وجود آلاينده هايي نظير PAH با استفاده از تغييرات غشاهاي زيستي در سلولهاي همولنف دوکفه اي مذکور تعيين مي شود. پس از نمونه برداري و انتقال نمونه ها به آزمايشگاه، آماده سازي آنها انجام و آناليزهاي شيميايي هم با استفاده از روشهاي گاز کروماتوگرافي جرمي (GC-Mass) صورت گرفته و مقادير PAHها تعيين و نتايج حاصل از روشهاي شيميايي فوقالذکر با نتايج بدست آمده از روش بيومارکري مقايسه مي گردد.
مواد و روشها:
١- نمونه برداري
پس از عزيمت به تالاب انزلي در بخش هاي مختلف تالاب گشت زني انجام شد و سرانجام در دو بخش ماهروزه و سلکه تعدادي اندک از دو کفه اي آنودونت مشاهده شد و در نهايت اين دو مکان به عنوان ايستگاههاي مورد نظر به طول حدود ١ کيلومتر انتخاب گرديدند. زمانهاي نمونه برداري از آنودونت ايستگاههاي مذکور هم اواخر خرداد- اوايل تير(ژوئن ) و اواخرشهريور(سپتامبر) انتخاب گرديد و با توجه به اينکه تفاوت شديد دمايي در فصول مختلف در انزلي مشاهده نمي شود در واقع ژوئن را مي توان فصل خشک و سپتامبر را فصل بارندگي در نظر گرفت .
بنابراين از هر ايستگاه با توجه به وجود آنودونت ها و تحقيقات مشابه ٧ عدد دوکفه اي آنودونت برداشت شد &Lowe and Fassato (١٩٩٥ ,Depledge). جهت بالا بردن اطمينان از نتايج ، در يک منطقه آلوده هم Cage گذاشته شود و نتايج حاصل از آن با نتايج ايستگاههاي مذکور مقايسه گردد. بنابراين تعداد ١٤عدد دوکفه اي آنودونت در يک Cage گذاشته شده و در ايستگاه آلوده يعني نزديک پژوهشکده شيلات (که محل توقف و سوخت گيري قايق ها بود) براي يک دوره چهار هفته اي يا ٢٨ روزه (٢٠٠٦ ,Nigro and et al) قرار داده شد.
اطلاعات ايستگاههاي نمونه برداري به شرح زير است :
١) ايستگاه cage : نزديک پژوهشکده شيلات، محل سوختگيري و استقرار قايق ها (ايستگاه آلوده)
٢) ايستگاه ماهروزه : (٤١٤٣١٩٣ UTM ,٠٣٥٩٧٣١ S ٣٩)
٣)ايستگاه سلکه : (٤١٣٩٣٠٥ UTM ,٠٣٦٣٤٧٣ S ٣٩)
لازم به ذکر است که نمونه هاي دو کفه اي هر ايستگاه بطور زنده و با رعايت شرايط لازم يعني در گالن هاي بزرگ و مجزا و همراه با آب تالاب قرارداده شد و سريعا به آزمايشگاه تهران منتقل گرديد.
٢- آزمايشات زيستي (NRR)Neutral Red Retention
پس از گذشت زمان ٤٨ ساعت و آدابته شدن دو کفه اي هاي بررسي آزمايشات Neutral Red Retention assay به شرح
زير آغاز گرديد:
تهيه محلولها طي مکاتبه در سال ٢٠٠٧ با مبتکراين روش آقاي David M. Lowe، مرکز آزمايشگاه دريايي Plymouth ، انگلستان) پروسه کامل کار Neutral Red Retention assay دريافت شده و بر طبق آن محلولهاي مورد نياز نظير نمک فيزيولوژيک،
Neutral Red
و (Working Soultion) تهيه گرديد. همچنين در ادامه استخراج همولنف دوکفه اي آنودونت طبق روش مذکور انجام شده و در طي آن مقدار ٠.١ ميلي ليتر از همولنف دو کفه اي با دقت از عضله پشتي برداشته مي شود. لازم به ذکر است که مقدار ٠.١ ميلي ليتر نمک فيزيولوژيک داخل سرنگ مذکور وجود داشته و با برداشتن ٠.١ ميلي ليتر از همولنف ، به سوسيانسيون ٥٠ : ٥٠ از نمک فيزيولوژيک و سلول دست خواهيم يافت .
سپس اين سوسيانسيون به داخل ميکروتيوب هاي سيليکوني ريخته شده و بعد با استفاده از ميکروپي پت ، ٤٠ ميکروليتر از اين سوسيانسيون بر روي مرکز لام پي پت مي شود.
قابل توجه است که مي بايست مرحله گرفتن همولنف سريع بوده و بيشتر از ٢ دقيقه طول نکشد.
حال لام ها به يک Chamber ضد نور انتقال داده شده تا سلولها بتوانند به هم بپيوندند. بعد از گذشت زمان ١٥ دقيقه لام ها از داخل Chamber برداشته شده و به آرامي با ز دن ضربه بر روي يک دستمال کاغذي مايع اضافي ريخته شده و بدين ترتيب يک لايه ظريف سلولي ١ روي لام باقي مي ماند. اين مرحله بايد سريع انجام شود و لام ها سريعاً به درون Chamber مرطوب برگردند تا Neutral Red در مرحله بعد اضافه گردد. سپس ٤٠ ميکروليتر از محلول Working، ساخته شده از Neutral Red برداشته شده و به هر يک از لام هاي مذکور که داراي يک لايه ظريف سلولي هستند اضافه شده و سپس يک لامل با دقت روي آن قرار داده مي شود. پس از گذشت زمان ١٥دقيقه ، مي توان لامها را با استفاده از ميکروسکوپ بررسي نمود ابتدا با عدسي ١٠ و بعد با بکارگيري عدسي ٤٠ مي توان تغييرات سلولي را در فواصل زماني مشخص ١٥، ٣٠، ٦٠، ٩٠، ١٢٠، ١٥٠ و ١٨٠ دقيقه بررسي و نتايج را يادداشت کرد. براي اسکن هر لام نبايد بيش از ١ دقيقه وقت صرف شود (١٩٩٤ ,Lowe).
پس از ١٥ دقيقه مجددًا تغييرات سلولي مشخص مي گردد. سپس هر ٣٠ دقيقه اين تغييرات بررسي ميشود و زمان اين بررسي ها حداکثر تا ١٨٠ دقيقه مي باشد که تا اين مدت تغييرات سلولي با از دست دادن رنگ مشاهده و قابل ثبت است . مهمترين تغييرات سلولي عبارتند از: تورم و بزرگ شدن سلولها ، تشکيل حفره (به واسطه واکوئله شدن ليزوزوم ) سلول،شکسته شدن (تخريب ) سلولها بر روي لام ، تجمع سلولي بطور پراکنده بر روي لام، برخي اوقات در ترکيب سلولي همولنف رنگ به بيرون تراوش مي کند (١٩٩٤ ,Lowe).
در هر صورت هر چه جانور در محيط آلوده تر باشد در اولين بررسي هاي ميکروسکوپي از سلولهاي همولنف ، سريعتر اين عوارض را بروز داده و جانوراني که در محيط هاي با استرس کمتر (آلودگي کمتر) باشند ديرتر اين عوارض را در بررسي ميکروسکوپي همولنف نشان مي دهند. اين بررسي زماني به پايان ميرسد که يا رنگ در زمان گفته شده از بين برود و يا تغييرات سلولي در ٥٠ درصد همو سايتها رخ دهد(١٩٩٤ ,Lowe).
با توجه به اينکه ترکيباتي نظير PAH ها آلي بوده انتظار مي رود بتواند با غشاء سلولي که داراي ترکيبات ليپوپروتئيني است وارد واکنش شده، عوارض فوق الذکر را بروزداده و آنها را ثبت نمود.
از آنجايي که در اين پروژه اين روش بيومارکر براي اولين بار بر روي سلولهاي همولنف آنودونت مورد بررسي قرار گرفته لازم بود تا با با روشهاي شيميايي هم مقايسه شود پس مي بايست مقادير آلودگي هاي نفتي از روشهاي دقيق شيميايي نظير GC– Mass هم تعين گردد. لذا با استفاده از دستور العمل (١٩٩٩) MOPAM مراحل آماده سازي و آناليزهاي شيميايي صورت پذيرفت . از مهمترين مزاياي روش بيومارکري اين است که موجود بطور زنده دوباره به دامان طبيعت باز مي گردد، اما در اين پروژه جهت ادامه آزمايشات دو کفه اي ها فريز شدند تا در مراحل بعدي آناليزهاي شيميايي بر روي آنها صورت پذيرد.
٣- آزمايشات شيميايي
جهت تعيين دقت و تأييد اينکه آيا مي توان آنودونت (Anodonta Cygnea) را به عنوان يک بيومارکر براي آلاينده هايي نظير
PAH معرفي نمود، مي بايست داده ها با روشهايي دقيق و تأييد شده شيميايي همانند روشهاي Mass -GC کنترل شود. بنابراين پس از اينکه نمونه ها از فريزر خارج شد با استفاده از دستگاه فريز دراير (مارک ZiRBus مدلVaCo) کاملاً خشک شده و سپس با توجه به بين ٣-٢ گرم از کل بافت ٢ دوکفه اي توزين شده و در ويالهاي مخصوص دستگاه مايکرو ويو پيشرفته Digestion system، (مارک Milestone مدل ETHOS١) ريخته شد (لازم به ذکر است با توجه به دستورالعمل دستگاه مايکرو ويو مذکور و حجم ويالهاي اين دستگاه مقادير مورد نياز بافت دو کفه اي توزين شده است ) و به هر ويال مقدار ٣٠ ميلي ليتر متانول مرک (٦٠٠٨ .Art) اضافه گرديد و درب آنها کاملاً بسته شده و براي هضم و استخراج اوليه به مدت ٣٠ دقيقه در فشار Bar ١٥ در دستگاه ميکروويو قرار داده مي شود. پس از آن و يالهاي حاوي نمونه ها از دستگاه خارج شده و به زير هود منتقل مي شود تا پس از خنک شدن بتوان درب آنها را باز نمود.
سپس جهت حل شدن چربي ها به هر يک ٢ ميلي ليتر محلول هيدروکسيد پتاسيم مرک (٣٣.١٠٠٠ ١.٥٠ .Art) ٠.٧ مولار و ٣ ميلي ليتر آب مقطر اضافه شده درب ويالها کاملاً بسته شده و مجدداً به دستگاه ماکروويو با شرايط قبلي منتقل مي گردد تا مرحله هضم کامل شود. پس از گذشت زمان نيم ساعت ويالهااز دستگاه ماکروويو خارج شده و پس از سرد شدن محتوي هر ويال به کمک خلا و قيف بوخنر و کاغذ صافي واتمن صاف شده، هر ويال با متانول شسسته شده و مجددا صاف مي شود، محلول صاف شده همراه با ٢٥ ميلي ليتر هگزان نرمال مرک (١٠٤٣٧١٢٥٠٠.Art) به يک قيف دکانتور منتقل شده و فاز بالايي که حاوي نمونه ها و حلال هگزان نرمال است استخراج مي گردد. مرحله استخراج دو بار تکرار مي شود تا استخراج کامل گردد.
قابل توجه است که جهت حذف آب احتمالي در هنگام صاف کردن نمونه مقداري سولفات سديم روي کاغذ صافي در قيف بوخنر ريخته شده و سپس عمليات صاف کردن نمونه انجام مي شود.
پس از آن مي بايست حلال اضافي از نمونه ها جدا شود بنابراين با کمک Rotary Evaporato حجم کل نمونه به ١٠ ميلي ليتر تقليل مي يابد. در مرحله بعد بايد نمونه استخراج شده فوق (با حجم حود ١ ميلي ليتر) از ستون با قطر ١ سانتيمتر (١٩٩٩ ,MOPAM-ROPME ) عبور داده شود.
ستوني از سليکاژل (mesh ASTM ٢٣٠ – ٧٠ ,١٠٧٧١٩ .Art) و آلومينا (١٠٧٦.Art) آماده شده و پس از انجام مراحل آماده سازي، ستون براي انتقال نمونه روتاري به درون آن آماده شده است و چون داراي سه بخش سيليکاژل، آلومينا و سولفات سديم با قطبيت هاي متفاوت است مي توان جدا سازي PAH ها را به خوبي انجام داد.
پس از انتقال نمونه به ستون فاز F٢ که حاوي هيدروکربورهاي آروماتيک است جمع آوري شده و آماده تزريق به دستگاه Mass –GC براي سنجش مقادير PAH هاست .
دستگاه Mass –GC استفاده شده در اين پروژه مارک N ٦٨٠ Agilent Technologies مي باشد. همچنين لازم به ذکراست که CRM آبزي مورد استفاده داراي کد ٤٠٦-IAEA و CRM مي باشد.
نتايج :
بعد از انجام آزمايشات، آناليزهاي آماري با استفاده از نرم افزار SPSS بر روي داده هاي نهايي صورت گرفته و از تست Nonparametric استفاده شد. همچنين براي بررسي ميزان همبستگي بين آلاينده هايPAH و روشNeutral Red Retention assay ضريب همبستگي pearson بکار گرفته شده که خلاصه نتايج در جدول ١ آورده شده است :
مشاهده مي شود که :
١- بين ميانگين PAH درآنودونتهاي سلکه خرداد ماه (ژوئن ) و آنودونتهاي سلکه شهريورماه (سپتامبر) اختلاف معني داري وجود دارد (١و٢ در جدول ١).
٢- همچنين بين ميانگين PAH درآنودونتهاي ماهروزه خرداد ماه (ژوئن ) و آنودونتهاي ماهروزه شهريورماه (سپتامبر) هم اختلاف معني داري وجود دارد (٣و٤ در جدول ١).
بررسي همبستگي بين آلاينده PAH ,NRR
بررسي نتايج تست همبستگي (جدول ٢) به وضوح نشان مي دهد که همبستگي منفي و معني دار بين متغيرهاي NRR, PAH وجود دارد و در فصول مختلف و ايستگاه هاي مختلف هم خوشبختانه اين هبمستگي منفي و معني دار وجود دارد يعني با افزايش مقدار PAH ، در زمان کمتر سلولهاي همولنف آنودونت در آزمايشات NRR عکس العمل نشان داده و با افزايش مقدار آلاينده سريعتر پايخ دهي سلولي صورت مي گيرد. اين همبستگي در هر دو فصل گرم (خرداد. ژوئن ) و فصل بارندگي (شهريور. سپتامبر) و همچنين در هر دو ايستگاه ماهروزه و سلکه و همچنين ايستگاه آلوده Cage مشاهده شده و اين همبستگي به هيچ عنوان به فصل (زمان) و ايستگاه (مکان) وابسته نيست (جدول ٢ جدول ١).
بحث :
با توجه به اهداف پروژه مقادير PAH ها در آنودونتهاي تالاب انزلي در اواخر خرداد ماه و اواخر شهريور ماه (در دو فصل گرم و
بارندگي )، در ايستگاه هاي ماهروزه و سلکه تعيين گرديد که در ادامه به بحث و بررسي پيرامون نتايج آنها پرداخته مي شود:
١) با توجه به نتايج حاصل از نمونه برداري هاي فصل بارندگي يعني اواخر شهريور (سپتامبر) و بررسي روند زماني مشخص مي شود که بطور چشمگيري مقدار PAHها در بافت آنودونتهاي ايستگاه ماهروزه در فصل بارندگي افزايش داشته است و نتايج آناليزهاي آماري با استفاده از آزمون(paramentent Non)و تست Mann- whitney u در جدول ١ اختلاف معني داري را بين مقادير PAHها در آنودونتهاي ماهروزه در خردادماه و شهريور ماه نشان مي دهد(٠٠١=P). بنظر مي رسدافزايش غلظت PAHهادر محيط را مي توان به ورود بيشتر اين آلاينده مربوط دانست . شهريور ماه، بارندگي شديد در منطقه وجود داشته و از آنجائيکه نمونه برداري ماهروزه در محل تلاقي چند رودخانه بوده است ، وجود سيلابهاي شديد که حاوي آلاينده هاست از طريق رودخانه هايي که به اين محل مي ريزند سبب بالا رفتن غلظت PAH در اين منطقه شده که طبعا بر روي آنودونتها که موجوداتي Filter feeder هستند تاثير مستقيم دارد.
٢) نتايج آماري در جدول ١ تاييد کننده اختلاف معني داري بين مقدار PAHها در آنودونتهاي ايستگاه سلکه در دو فصل خرداد ماه و شهريور ماه است (٠.٠٠١ =P).
بنظر مي رسد در فصل بارندگي همراه با افزايش آب تالاب و افزايش آب رودخانه هايي که معمولا حاوي پسابهاي آلوده مناطق اطراف بوده و به تالاب مي ريزند، اين افزايش بار آلودگي در فصل بارندگي منطقي باشد.
٣) همچنين بين ميزان PAH در آنودونتهاي ايستگاه سلکه و ماهروزه با آنودونتهاي ايستگاه Cage اختلاف معني داري مشاهده مي شود (٠.٠٤٣ =P) و اين امر قابل انتظار بوده چون با توجه به اينکه در اين ايستگاه سوختگيري قايق ها انجام مي شود انتظار مي رفت آلودگي ترکيبات PAH در اين ايستگاه قابل توجه باشد، اما نکته مهم اين است که چطور با وجود بالا بودن ΣPA در ايستگاه مذکور، ميزان اين آلاينده در بافت آنودونت افزايش بيشتري را نشان نداده است ؟ به نظر مي رسد گرچه ترکيبات PAH ليپوفيل بوده و پس از ورود بر بدن دوکفه اي مي توانند در آنجا متمرکز شوند ولي احتمالا نرخ تجمع زيستي در بدن موجود شديدا به زمان وابسته است و زمان ٢٨ روز براي تجمع آلاينده در بدن دوکفه اي کافي نيست . از طرف ديگر از بين رفتن ٥٠% از دوکفه اي ها نشان مي دهد که احتمالا عوامل ديگري در زنده بودن دوکفه اي مي توانند دخيل باشند نظير جنسيت ، سن و احتمالا فيزيولوژي و ميزان متابوليسم آلاينده در بدن دوکفه اي که نياز به تحقيقات بيشتر دارد.
علاوه بر موارد فوق با بررسي ميزان PAH∑ در بافت آنودونتهاي ايستگاه مورد بررسي و با تحقيقات مشابه در خصوص دوکفه اي
هاي ساير کشورها مشاهده مي شود که ميزان PAH∑ در بافت آنودونت ايستگاههاي ماهروزه و سکله و Cage در تمامي موارد (بجز Rock oyster در امارات متحده) بيشتر از دوکفه اي هاي کشورهاي حوضه خليج فارس مي باشد و اين موضوع مي تواند هشداري براي آلوده شدن محيط زيست تالاب انزلي باشد که بايد مورد توجه مسئولين مربوطه قرار گيرد.
مهمترين بخش اين پروژه بررسي ارتباط بين غلظت شيميايي آلاينده هاي PAH و پاسخ بيولوژيک سلولهاي همولنف آنودونت است .
نتايج تست همبستگي حاکي از آن است که همبستگي منفي قوي و معني داري بين مقدار PAH ها و زمان بروز عوارض در آزمايشات NRR وجود دارد. اين همبستگي قوي در تمام فصول نمونه برداري و ايستگاههاي مختلف بصورت منفي و معني دار وجود دارد و حتي همانطور که در جدول فوق الذکر مشهود است بدون در نظر گرفتن فصل و ايستگاه هم اين همبستگي منفي و معني دار مشاهده مي شود (٠.٠٠٥)٠.٧٦١- =(r)P. بنابراين بين مقادير PAH و زمان نشان دادن عوارض در آزمايشات NRR و پاسخ دهي سلولهاي همولنف ، نسبت معکوس و البته معني دار وجود دارد، (نمودارهاي ١ تا٤).
بنظر مي رسد PAH ها مي توانند همراه با آب و مواد غذايي (با توجه به Filter feeder بودن آنودونتها) وارد بدن آنودونت و همولنف شده و چون ترکيباتي آلي و ليپوفيل هستند بر روي غشا ليپو پروتئيني سلولها تاثير گذاشته ، با آنها وارد واکنش شده و در نتيجه سبب تخريب غشا مي گردد و عکس العمل هايي را بصورت عوارض مذکور (نظير تخريب غشا، از دست دادن رنگ و...) نشان مي دهند. و در نتيجه هرچه غلظت PAH بالاتر باشد سبب مي شود تا سلول سريعتر تخريب شده و اين عوارض را بروز دهد.
