بخشی از مقاله
بیان، خالصسازي و بررسی فعالیت آنزیم آسپارتیل پروتئیناز ترشحیSAP2 کاندیدا آلبیکنس در سیستم مخمري پیکیا پاستوریس
چکیده
هدف: آنزیم آسپارتیل پروتئیناز ترشحی (SAP2) کاندیدا آلبیکنس نقش محوري در اتصال، تهاجم و بیماريزایی این مخمر فرصتطلب دارد. هدف از این مطالعه کلون نمودن، بیـان و بررسـی خـصوصیات بیوشـیمیایی آنـزیم SAP2 است. همچنین در این تحقیق براي اولین بار، از سیستم یوکاریوتی پیکیا پاسـتوریس بـراي بیـان پـروتئین نوترکیب SAP2 استفاده شد.
مواد و روشها: ژن Sap2 کاندیدا آلبیکنس با انتهاهاي چسبان EcoR1 و SacII توسط PCR تکثیر و درون ناقل T/A سابکلون شد. با اسـتفاده از آغازگرهـاي عمـومی تـوالی ایـن ژن تعیـین شـد و سـپس درون ناقـل بیـانی pGAPZαA قرار گرفت. سازه نوترکیب به درون مخمر پیکیا پاستوریس انتقال داده شـد. ژن Sap2 طـی پدیـده نوترکیبی همولوگ درون ژنوم مخمري پیکیا پاستوریس داخل شد. پروتئین بیـان شـده بـه کمـک روش وسـترن بلاتینگ و با استفاده از آنتیبادي مونوکلونال بر علیه پروتئین SAP2 تأیید شد. در نهایت پروتئین بهدست آمده بـا کمک ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی Ni-NTA تخلیص و فعال بودن آنزیم تأیید شد.
نتایج: در این تحقیق تکثیر ژن Sap2 کاندیدا آلبیکنس و وارد نمودن آن درون ژنوم مخمر بیانی پیکیا پاستوریس با روش نوترکیبی همولوگ انجام شد. علاوه بر این، کلونی از مخمر را بهدست آمد که پروتئین نوترکیـب SAP2 را به محیط ترشح میکرد. بالاترین بیان پس از طی زمان 96 ساعت در دماي 30 درجه سانتیگراد بهدست آمد.
نتیجه گیري: القاي ژن Sap2 در مخمر پیکیا پاستوریس منجر به افزایش قدرت بیان انبوه این ژن نسبت به سیـستم بیانی باکتریایی میشود. همچنین نیاز به تغییرات بعد از ترجمه و فعال نمودن آنزیم، به علـت اسـتفاده از سیـستم بیانی یوکاریوتی، از بین میرود. برطبق یافتههاي تحقیق حاضر، آسپارتیل اسید پروتئینـاز تخلـیص شـده در ایـن تحقیق خود فعال بوده و قادر به تجزیه BSA بهعنوان یک سوبسترا است. این پروتئین نوترکیـب در pH اسـیدي بیشترین فعالیت را دارد.
کلیدواژگان: کاندیدا آلبیکنس، کلونینگ Sap2، پیکیا پاستوریس
-1 مقدمه
کاندیدا آلبیکنس (Candida albican) یکی از مهـمتـرین مخمرهاي بیماريزاي انسان است. این مخمر فرصـتطلـب دو شکلی (Dimorphism) (هیف، مخمر) اغلب بهصـورت فلـور طبیعی در سطوح مخـاطی وجـود دارد امـا مـیتوانـد بـه یـک عامل تهدیدکننده زندگی در افرادي با پاسخ ایمنی کـاهشیافتـه ناشــی از ســرطان، درمــان طــی پیونــد اعــضا، افــراد HIV+ (Human Immunodeficiency Virus) و افرادي با بیماريهاي زمینــهاي تبــدیل شــده و ایجــاد کاندیــدیازیس سیــستمیک (Systemic Candidiasis) نمایـــد .[1] چنـــدین فـــاکتور مــستعدکننده ماننــد قــدرت چــسبندگی، دو شــکلی، تغییــرات شـکل ظـاهري (Phenotype switching)، سـرکوب سیـستم ایمنـــی و تولیـــد فـــسفولیپازها و آســـپارتیل پروتئینازهـــا (Aspartic Proteinases)، براي بیماريزایـی کاندیـدا مطـرح شده است .[2] از بین فاکتورهـاي مـؤثر در بیمـاريزایـی ایـن مخمـر، وجـود آنـزیمهـاي آسـپارتیل پروتئینازهـاي ترشـحی (Secreted Aspartic Proteinase: SAP) بـهعنـوان فـاکتور بیماريزایـی بـالقوه، مطـرح اسـت. وجـود SAP هـا و تهـاجم گونــههــاي کاندیــدا بــا آزمــونهــاي بیوشــیمیایی، ژنتیکــی و ایمنوشیمی ثابت شده است .[3]
شش ژن نسبتاً همسان Sap1-Sap6 براي ترشـح پروتئینـاز در کاندیدا آلبیکنس وجـود دارد. کاندیـدا آلبیکـنس در حالـت مخمري در ابتدا یک مجموعه از ژنهـا شـامل Sap1-3 را بیـان میکند که بیشتر در عفونـتهـاي مخـاطی بیـان مـیشـوند. در عوض در شکل هیف ابتدایی، دیگـر اعـضاي ایـن ژنهـا شـامل Sap4-6 بیان میشوند که مؤثر در ایجاد عفونـتهـاي سیـستمیک هستند. نقش آنزیم SAP1 در ایجاد حفره در سطوح مخاطی بدن و توانایی آنزیمهاي SAP1-3 در چسبندگی به سلولهاي پوششی ثابت شده است و SAP5,6,9 در تولید بیـوفیلم (Biofilm) مـؤثر است 4]، .[5 سویههاي کاندیدا آلبیکنس با ژنهـاي حـذف شـدهSap1 و Sap3 صدمات بافتی کمتري در سـاختار اپیتلیـوم انـسان (Reconstituted Human Epithelium: RHE) دارد. همچنین این سویههاي جهـشیافتـه، چـسبندگی کمتـر بـه سـلولهـاي پوششی دهانی و بیماريزایـی کمتـر در مـدل واژینیـت مـوش نشان دادند. سویههاي این مخمر که ژن Sap2 آنها حذف شده بود، تقریباً هیچ نشانهاي از بیماريزایی در مدل واژینیت تجربی در موش نداشت. بهعلاوه تجزیه بافتهاي مـوش آلـوده شـده، نشان داد که حذف ژن Sap2 در مخمر کاندیدا آلبیکنس توانایی چـسبندگی مخمـر بـه سـطوح سـلولی و ایجـاد کلونیزاسـیون (Colonization) را به شدت کاهش داده است .[6] در آزمـون ایمنوفلورسنت (Immunofluorescent) با استفاده از آنتیباديهاي اختصاصی، وجود پروتئینهاي SAP بهعنوان آنتـیژن در سـطح دیــواره ســلولی کاندیــدا آلبیکــنس طــی نفــوذ بــه بافــت در کاندیدیازیس سیستمیک و عدم توانایی ماکروفاژها در فاگوسیتوز سلولهاي کاندیدا ثابت شده است .[7]
تحقیـق روي SAP7 نـشان داده کـه ایـن SAP تنهـا طـی عفونت داخل رگی کاندیدیازیس تولیـد مـیشـود و نقـشی در عفونت واژنی در موشهـاي مـورد مطالعـه نـدارد. گـروههـاي آزمایش مانند جهشیافتههاي فاقد (Sap 7 ) Sap7 هـیچ نقـشی در ایجاد عفونت مخاطی نداشت .[8]
کاندیــدا آلبیکــنس 8 کرومــوزوم دیپلوئیــد دارد کــه از بزرگتـرین بـه کوچـکتـرین کرومـوزوم بـهصـورت 1 تـا 7 شمارهگذاري میشود و همچنین داراي یک کروموزوم با اندازه بسیار متغیر است که از سایرین بزرگتر بوده و با R نـشان داده میشود. این کروموزم داراي دو قـسمت اتـصال اضـافی متغیـر است که براي RNA ریبوزومی (rRNA) کد میشود. بررسـی ترادف ژن Sap وجود خانواده این ژنهـا را روي کرومـوزم R کاندیدا آلبیکنس نشان میدهد .[9] در گونه بسیار شایع کاندیدا آلبیکنس وجـود 10 ژن Sap از Sap1-10 گـزارش شـده اسـت.
ترادفهاي آمینواسیدي SAPهاي کاندیدا آلبیکـنس نـشان داده کــه درصــد شــباهت بــین SAP1، SAP2 و SAP3 در حــدود 68 درصـد و بـین مـابقی اعـضا 25 درصـد اسـت .[10] بیـان ژنهاي Sap طی چرخه زندگی کاندیدا آلبیکنس بسته به شکل یا فنوتایپ آن متفاوت بوده و بهصورت افتراقـی تنظـیم و بیـان میشود .[11] براي مثال تولید بیشتر آنـزیم SAP4 طـی شـکل بیماريزایی هیف بیان میشود؛ در حالیکـه SAP2 در حـضور (Bovine Serum Albumin) BSA بهعنوان منبع نیتـروژن و از کلونیهاي سفید بهدسـت مـیآیـد. آنـالیز نـورترن بلاتینـگ (Northern blotting) از خانواده SAPهاي کاندیدا نـشان داد که SAP1 و SAP3 طی تغییرات شکل ظاهري کلونهاي مـات (Opaque) به سـفید در سـویه WHO-1 تولیـد مـیشـود در حالیکه SAP2 طی جوانه زدن و تشکیل هیف در این مخمر و در محیط حاوي پروتئین بهعنوان منبع نیتروژن تولیـد مـیشـود .[12] این پدیده میتواند نشاندهنده این مسئله باشد که کاندیدا آلبیکنس نیازمند پروتئینازهاي خاص در هر مرحلـه از رشـد و ایجاد بیماري بوده و همچنین هر آنزیم ویژگیهاي خاص خود را دارد که با بقیه متفاوت است .[13] در یک مطالعـه 4 سـوش از کاندیـدا آلبیکـنس ســوشهـاي H12 و ATCC10261 بــا قدرت بیماريزایی بـالا و دو سـوش مقـاوم بـه کلوتریمـازول N (Clotrimazole) و P بــهمنظــور بررســی توانــایی ایجــاد عفونت واژنی در مدل موش بزرگ آزمایشگاهی (رت) بررسـی شد. نتایج نشان داد توانایی اتصال کاندیـدا بـه پوشـش واژن و ایجـاد کاندیـدیازیس واژنـی در واژینیـت رت بـه بیـان دو ژن آسپارتیل پروتئیناز Sap1 و Sap2 مربوط اسـت. آنـالیز سـاترن بلاتینگ (Southern blotting) به روش نقطـهاي (Dot blot) و نــورترن بــلات (Northern blotting) از دورگــهســازي RNA (Hybridization)هاي استخراج شـده از مـایع واژنـی موشهاي آلوده شده از هـر سـوش بـا پـروبهـاي (Probes) اختصاصی نشان داد که در سوشهاي بـا قـدرت بیمـاريزایـی بالا، هر دو ژن طی هفته اول عفونت بیـان مـیشـود. در مقابـل هـیچ ژنـی طـی عفـونی کـردن رتهـا بـهوسـیله سـویههـاي غیربیماريزاي N بیان نشد. سوش نسبتاً بیمـاريزاي P هـر دو ژن Sap1 و Sap2 را بیان میکرد؛ اما سطح mRNA هر دو ژن پایین بود. همچنین سـطح mRNA ژن Sap1 زودتـر از سـطح mRNA ژن Sap2 کاهش مییابد. در مورد چسبندگی و اتصال در هیستوپاتولوژي بافتهاي عفونی شده با رنگآمیـزي بـافتی(Providian Acid Shift) PAS نـشان داده شـد کـه سـوش غیرواژینوپاتیک N کمتر از سوشهاي بیماريزاي بـالقوه H12 و ATCC10261 و سوش نسبی P به سلولهاي پوششی واژن متصل میشود. همچنین قدرت تحریک تولید سلکتین E (یکی از اعضاي خانواده مولکولهـاي چـسبان در رونـد التهـاب) در آنها بالاتر است. نتایج این تحقیق یک رابطه آشکار بین توانایی سوشهاي عفونتزا با ترشح SAP را ثابت کرد .[14] یکـی از اختصاصات اصلی آنزیمهاي SAP کاندیدا آلبیکنس کـه باعـث تمــایز آن از آســپارتیل پروتئینازهــاي ســلولهــاي پــستانداران میشود، داشتن ترادفهاي ترجیحـی (Residue preference) در دو جایگاه اختصاصی P1 و P1׳ است که وجود این دو ناحیه باعث تشخیص محل برش در سوبسترا و اختـصاصی شـدن آن میشود. براي مثال با توجه به اینکـه SAP1، SAP2، SAP3 و SAP6 باندهاي پپتیدي بین آمینواسیدهاي آبگریز بزرگتـر را میشکند، اما دو ناحیـه P1 و P1׳ اختـصاصی هـر آنـزیم اسـت بهطوري که SAP1,2,6 فنیل آلانین و SAP3 لوسین را در محـل P1 ترجیح میدهد. بر پایه این گزارشها احتمـالاً نقـش اصـلی این پروتئینازها در کاندیدا آلبیکنس فـراهم آوردن تغذیـه بـراي سلول اسـت .[15] آنـزیم آسـپارتیل پروتئینـاز اسـیدي SAP2 یکی از مهمترین عوامل بیماريزایی مخمر بیماريزاي کاندیـدا آلبیکنس است. استخراج و خالصسازي ایـن آنـزیم از محـیط کشت کاندیدا در مقادیر پایین و بهصـورت خـالص، بـهمنظـور مطالعه عملکرد و فعالیت آنزیم، امکانپـذیر نیـست. عـلاوه بـر این، تحقیق روي سویههاي کاندیدا آلبیکنس بیماريزا در ایران در مبحث آنزیمهاي SAP و تولید ناقلهـاي نوترکیـب از ایـن آنزیمها انجام نشده است؛ به همین دلیل محققـان حاضـر بـر آن شـدند تـا بـا بیـان مهـمتـرین آنـزیم خـانواده SAPهـا از نظـر بیماريزایـی (آنـزیم (SAP2 در یـک ناقـل مناسـب و تخلـیص پروتئین نوترکیب به یک منبع دائمی تولید آنزیم فوق دست یابنـد تا در مطالعات بعدي بتوان از آن براي تهیـه واکـسن، کیـتهـاي تشخیصی، تولید دارو علیه این مخمر و سایر مطالعـات در ایـران، استفاده نمود. همچنین در این مطالعه براي اولـین بـار از سیـستم یوکــاریوتی پیکیــا پاســتوریس (Pichia pastoris) بــهمنظــور تهیه شد. آنتـیبـادي مونوکلونـال SAP2 (Monoclonal) بـراي کلون و بیان آنزیم SAP2 استفاده شد. انجام وسترن بلاتینگ از شرکت Takara ژاپن تهیه شد.
-2 مواد و روشها
-1-2 پلاسمیدها و مواد واکنش
همــه پلاســمیدها بعــد از انتقــال (Transfer) بــه روش استاندارد، تکثیر و خالص شدند .[16] براي رشد مخمر پیکیاي نوترکیـب از محـیط کـشت (Yeast extract-Peptone- YPD Dextrose)، حاوي 100 میکروگرم بر میلـیلیتـر آنتـیبیوتیـک زئوسین (Zeocin) (خریداري شـده از (Invitrogen اسـتفاده شد. DNA ژنومی کاندیدا آلبیکـنس بـا روش فنـل- کلروفـرم [17] استخراج شـد. آنـزیمهـاي آنـدونوکلئاز EcoR1 و SacII (تهیه شده از شرکت (Takara هریـک بـا غلظـت 15 واحـد در میکرولیتــر، 25 (Fermentas) BspH1 واحــد در میکرولیتــر وDNA لیگاز (Fermentas) T4 با غلظت 5 واحـد در میکرولیتـر
-2-2 تکثیر PCR از ژن Sap2
ژنوم کاندیدا آلبیکنس بهعنوان الگو بـراي تکثیـر ژن Sap2 استفاده شد. با استفاده از آغازگرهـایی (Primers) کـه حـاوي ترادفهاي برشگر EcoR1 و SacII است، کپیبـرداري از ژن Sap2 کاندیدا آلبیکـنس بـا طـول 1200 جفـتبـاز انجـام شـد (جدول .(1 در طراحی آغازگرها بـراي اطمینـان از عـدم وجـود توالیهاي تکراري یا مکمـل نـرمافـزار Gene Runner اسـتفاده شـد. آغازگرهـا توسـط شـرکت Bioneer بـا درجـه خلـوص (High Purified Salt Free) HPSF بـهصـورت لیـوفیلیزه (Lyophilized) ساخته شدند. شماره دستیابی ژن مورد مطالعه در (National Center Biotechnology Information) NCBI، ID3647354 است.
نواحی خط کشیده شده جایگاه شناسایی آنزیم EcoR1 در آغــازگر جلــویی (Forward) و SacII در آغــازگر برگــشتی (Reverse) است .
برنامه PCR بهصورت زیر اسـتفاده شـد: واسرشـتسـازي اولیه (Initial Denaturation) بـهمـدت 2 دقیقـه و 30 ثانیـه، واسرشتسازي ثانویه بهمدت 30 ثانیـه هـرکـدام در 94 درجـه سانتیگـراد، دمـاي اتـصال (Annealing) آغـازگر، 45 درجـه سانتیگراد و بهمدت 30 ثانیه، دماي طویلسازي (Extension) 72 درجه سانتیگراد و بهمدت 2 دقیقـه و طویـلسـازي نهـایی بــراي 10 دقیقــه انجــام شــد. تعــداد 33 چرخــه بــه دســتگاه داده شد. غلظـت DNA الگـو 1 میکروگـرم و غلظـت Mg2+،3 میکرومولار بود.
-3-2 کلون Sap2 درون پلاسمید T/A
به دلیل بروز مشکلات متعدد در فرایند کلونینگ بـه روش نوترکیبی همولوگ، تصمیم گرفته شد که کلونینگ ابتدا در ناقل T/A انجام شود. به این منظور قطعات ژنی ابتدا به کمک PCR و با زمان 20 دقیقه در مرحله طویلسـازي نهـایی تکثیـر شـد. محصول PCR در غلظت 10/8 نانوگرم در میکرولیتـر پـس از تخلیص بهوسیله DNA لیگـاز (Fermentas) T4، لیتـوانی بـه ناقل کلونینـگ (Fermentas ) pTZ57R/T، لیتـوانی متـصل و پلاســمید T/A-Sap2 بــود. پلاســمید حاصــل درون بــاکتري اشرشیاکلی (Escherichia coli) ترانسفورم شد. بـاکتريهـاي ترانسفورم شده روي محیط LB آگـار (Luria Bertani agar) حاوي آمپیسیلین (Ampicillin) رشـد کـرد. ناقـل نوترکیـب پـس از اسـتخراج، تعیـین تـوالی (Sequencing) شـد. تـوالی صــحیح ژن Sap2 توســط تعیــین تــرادف هــر دو رشــته (Double-strand sequencing) و بــا آغازگرهــاي عمــومی (Universal) تأیید شد. هـضم آنزیمـی بـا همـان آنـزیمهـاي EcoR1 و SacII، Colony-PCR و تعیین توالی همگی تأیید بر اثبات ژن Sap2 بود.
-4-2 تراریختی (Transgenic) درون مخمر پیکیا پاستوریس
ناقـــل اســـتفاده شـــده در ایـــن تحقیـــق pGAPZαA (Invitrogen) اســـت. ایـــن ناقـــل داراي ژن مقاومـــت بـــه آنتیبیوتیک زئوسین است. این ناقل داراي دم پلیهیـستیدین و اپیتوپ C-myc بوده که بهترتیب براي تخلیص و تأیید وجود پــروتئین ترشــحی نوترکیــب اســتفاده مــیشــود. بــهمنظــور سابکلونینگ قطعه ژنی مورد نظر از ناقل T/A به داخـل ناقـل بیانی pGAPZαA و با توجه به وجود کدون آغـاز در آغـازگر فرادست، دو آنزیم برشی محدودالاثر در دو طرف منطقـه ورود ژن در ناقل T/A انتخاب شـد. بـدین منظـور سـازه نوترکیـب T/A-Sap2 و نیز ناقل بیانی pGAPZαA به کمک آنـزیمهـاي محــدودالاثر EcoR1 و 15) (Takara) SacII واحــد در هــر میکرولیتر) بریده شدد. سپس واکنش الحاق با نسبت 5 بـه 1 از غلظت 50 نانوگرم در هر میکرولیتر از pGAPZaA و محصول PCR برابر 10 نانوگرم در هر میکرولیتـر بـا اسـتفاده از آنـزیم DNA لیگاز (Fermentas) T4 در دماي 16 درجه سانتیگـراد انجام شد. پس از آن محصول واکـنش اتـصال بـه سـلولهـاي باکتریایی مستعد اشرشیاکلی سویه XL1-Blue وارد شد. ناقـل نوترکیــب Sap2+pGAPZαA درون بــاکتري تکثیــر شــد.
باکتريهاي ترانسفورم شده قادر به رشد در محیط LB حـاوي 100 میکروگرم بر میلیلیتر آنتیبیوتیک زئوسـین بـود. پـس از استخراج از درون باکتري بهمنظور ترانـسفورم در مخمـر پیکیـا پاستوریس، Sap2+pGAPZαA با آنـزیم اختـصاصی BspH1 25) (Fermentas) واحد در هر میکرولیتـر) خطـی شـد. ایـن آنـزیم ناقـل فـوق را در محـل پروموتـور آن کـه بـراي انجـام نـوترکیبی همولـوگ ضـروري اسـت، بـرش مـیدهـد. بـراي حساسسازي مخمـر پیکیـا پاسـتوریس، سـویه مخمـري درون محیط YPD بهمدت یک شبانه روز کـشت داده شـد و سـپس وکتور نوترکیب به روش Litium acetate/ssDNA/PEG بـه داخل مخمر حـساس شـده انتقـال داده شـد .[18] مخمرهـاي ترانــــسفورم شــــده روي پلیــــتهــــاي YPD حــــاوي 10 گرم عصاره مخمر، 20 گـرم پپتـون (Peptone) و 20 گـرم گلـوکز در یـک لیتـر از محـیط بـه همـراه 100 میکروگـرم در میلیلیتر زئوسین در 30-28 درجه سانتیگـراد بـهمـدت 4 روز کشت داده شد و کلونیها تشکیل شد.
-5-2 تأیید انجام نوترکیبی هومولوگ
براي تأیید ادغام ژن Sap2 به درون ژنوم پیکیا پاسـتوریس، DNA کرومــوزمی پیکیــا پاســتوریس بــه روش DNA fast استخراج [16] و با اسـتفاده از آغازگرهـاي AOX1 و pGAP که مکمل با مناطق همولوگ با ژنوم پیکیا میباشد، PCR انجام و باند 1800 جفتبازي مورد انتظار بهدست آمد. کلونهـایی از مخمر با ترانسفورم ناموفق که ژن Sap2 موفـق بـه ادغـام درون آنها نشده بود، باند 600 جفتبازي داشتند.
تــرادف pGAP (پروموتــور گــالاکتوز) هــم روي ناقــل pGAPZαA و هم روي ژنوم مخمر پیکیا پاسـتوریس موجـود است و محل انجـام نـوترکیبی همولـوگ بـین ناقـل نوترکیـبpGAPZαA بــههمــراه ژن وارد شــده Sap2 اســت. تــرادف AOX1 روي ناقل قرار دارد. بـین دو ناحیـه ذکـر شـده محـل ورود ژن Sap2 است. آغازگرهاي طراحی شده فوق درست در ناحیه قبل و بعد از ژن الحاقی روي ژنوم مخمر قـرار داشـته و بنابراین در صورت انجام صحیح نوترکیبی همولوگ، محـصول PCR باید شامل ترادف ژن وارد شـده درون مخمـر (Sap2) و تــرادفهــاي مربــوط بــه دو ناحیــه AOX1 و pGAP باشــد.
واکنش PCR به تعداد 30 چرخـه در حجـم 25 میکرولیتـر بـا اســتفاده از 1 میکروگــرم از DNA ژنــومی مخمــر و غلظــت Mg2+، 1/75 میکرومولار انجام شد.
-6-2 تأیید بیان پروتئین نوترکیب
بیان SAP2 در مخمر پیکیا پاستوریس بهوسیله SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) و وسترن بلاتینگ (Western Bloting) تأیید شد. 60 میکرولیتـر از محلول رویی محیط کشت حـاوي اسـید پروتئینـاز کاندیـدا آلبیکنس بهوسیله SDS-PAGE جدا و پـروتئینهـا ازروي ژل به غشاي نیتروسلولزي 0/45 میکرومتـر بـا اسـتفاده از سیـستم (Sigma) Minitrans blot منتقل شد. سپس غشاها با محلـول شستشو ]بافر (Phosphate Buffered Saline) PBS حـاوي کلرید سدیم، کلرید پتاسـیم و فـسفات دي سـدیک بـه همـراه توئین [(Tween 20) 20 شسته و درون محلـول بلوکـه کننـده (بافر PBS به همراه سرم آلبومین گاوي) براي 1 ساعت انکوبه شد. غشاها بریده و با آنتیبادي مونوکلونال Anti-Sap2p موش براي یک ساعت در درجه حرارت اطاق و براي یک شب در 4 درجه سانتیگراد انکوبـه شـد. بعـد از شستـشو بـا Anti-IgG کونژوگه شده با پراکسیداز انکوبه شـد. بعـد از آن بـا H2O2 و ديآمینو بنزن (Diaminobenzidine: DAB) انکوبـه شـد تـا باندها مشاهده شود.
-7-2 تخلـیص پـروتئین SAP2 نوترکیـب بـا ستون کروماتوگرافی تمایلی نیکل
یک کلون از مخمر نوترکیب پیکیا پاستوریس ترشح کننـده آنزیم SAP2 در 50 میلـیلیتـر محـیط YPD حـاوي 10 گـرم
عصاره مخمر، 20 گرم پپتـون و 20 گـرم گلـوکز در یـک لیتـر بهمدت 4 شـبانهروز در 30 درجـه سـانتیگـراد تحـت شـرایط هوازي کشت داده شد. بعد از رسـوب مخمرهـا، 50 میلـیلیتـر محیط کشت بهوسیله فیلترهـاي آمیکـون (Amicon filter) بـا سطح حـداقل (Molecular weight) mw 10000 (Cut off) به 10 میلیلیتر تغلیظ شد. بهوسیله 6 NaOH مولار pH محیط کشت از pH=3 به pH=7 رسانده شد. بعد از دیـالیز بـراي 12 ساعت با بافر سدیم سیترات 10 میلـیمـولار و pH=8/6، مـاده تغلـیظ شــده بــه ســتون (Agaros Nickel His- Ni-NTA select) منتقل شد. در ستون کروماتوگرافی میـل ترکیبـی (Ni-Qiagen) NTA)، آلمـان) پـروتئینهـاي حـاوي His-tag بـا تمایل بـالا بـه آن متـصل مـیشـود. سـتون در دمـاي 4 درجـه سانتیگراد و در حالت به هم زدن بهمدت 1/5 سـاعت انکوبـه شد تا اتصال پروتئین مورد نظر با یونهاي نیکل صورت گیـرد.
در این فرایند باند پروتئینـی مـورد نظـر، بـهوسـیله ایمیـدازول (Imidazole) (با غلظت 400-250 میلیمولار) از ستون خارج شد. در پایان فرایند تخلیص محصول به کمـک SDS-PAGE 12 درصد و وسترن بلاتینگ تأیید و مقدار محـصول بـهدسـت آمده با روش برادفورد (Bradford) سنجیده شد.
-8-2 بررسی فعالیت پروتئولیتیکی آنزیم SAP2
آنــزیم SAP2 یــک پروتئــاز بــوده و داراي سوبــستراهاي متعــددي از قبیــل کــازئین (Casein) و BSA اســت. در ایــن تحقیق براي بررسی فعال بـودن آنـزیم تولیـدي از سوبـستراي BSA استفاده شد. محلـول 270 میکرولیتـر از 1 BSA درصـد (وزنی/حجمی: (W/V در بافر 50 KCl میلیمولار با pH=5/3
تهیه و به آن 225 میکرولیتر 30) میکروگرم) از محلـول حـاوي آنزیم تخلیص شده اضافه شد. نمونه کنتـرل منفـی، سوبـستراي BSA بــدون آنــزیم فــوق اســت. بعــد از انکوباســیون در 37 درجه سانتیگراد، براي 1 ساعت فعالیت
