بخشی از مقاله
چکیده
سیستم بیانی مخمر پیکیا پاستوریس مهمترین ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئین نوترکیب است. هدف از این مطالعه بررسی میزان تولید پروتئین FSH گاوی نوترکیب در ارلن و بافل فلاسک بود. برای این منظور پروتئین FSH گاوی نوترکیب در سیستم پیکیا پاستوریس و با استفاده از محیط BMMY در PH=6 و دمای 30 درجه و القای %0/5 متانول تولید شد. سپس با TCA تغلیظ شدند و برای بررسی بیان از روش SDS-PAGE و رنگ آمیزی با نیترات نقره استفاده شد. حضور باند واضحتر در ناحیه 16 KDa نشان داد که میزان بیان در بافل فلاسک بسیار بیشتر از ارلن است.
کلمات کلیدی: هورمون محرک فولیکول - - FSH، ظرف کشت، مخمر پیکیا پاستوریس، .TCA
.1 مقدمه
پیکیا پاستوریس یک سیستم بیانی مفید با بازدهی موثر و یک ابزار تجربی وکاربردی در مهندسی پروتئین به شمار می رود .[1] قابلیت دستکاری ژنتیکی آسان، رشد سریع بر روی محیطکشت ارزان با غلظت سلولی بالا و توانایی اصلاحات پسترجمهای پیچیده را دارا میباشد 3]،.[2 علاوه بر این محصولات نوترکیب تولیدشده در آنها عاری از سم و آلودگی به DNA ویروسی است .[4]
اهمیت ویژه مخمر پیکیا پاستوریس، توانایی ترشح پروتئین خارجی در محیط کشت میباشد. محصول ترشحشده میتواند بیشتر از 80 درصد پروتئینهای محیطکشت را شامل شود .[5] پروموترهای AOX1 و AOX2 در مخمر پیکیا-پاستوریس و به عنوان پروموترهای طبیعی و اصلی شناسایی گردیدند که موفقیت سیستم بیانی پیکیاپاستوریس به میزان زیادی به دلیل وجود پروموتر AOX میباشد.[6] پروموتر AOX بهشدت توسط متانول تحریک و توسط منابع کربنی دیگر نظیر گلیسرول و گلوکز متوقف میشود 1]، .[7 مخمرهای متیلوتروف مانند پیکیا پاستوریس یک مسیر عمومی و مشابه برای استفاده از متانول میباشند .[8]
این گروه میتوانند از متانول بهعنوان تنها منبع کربن استفاده نمایند؛ به این صورت که پس از ورود متانول به محیطکشت مخمر، پروموتر فعال شده و در پی آن ژن الکل اکسیداز بیان میشود .[9] یکی از مزایای عمدهی استفاده از پیکیاپاستوریس به عنوان سیستم بیانی توانایی اصلاحات پس ترجمهای پروتئینهای نوترکیب میباشد. دسترسی به سویههای مهندسی شده در پیکیاپاستوریس، آنها را به سیستم بیانی مفیدی برای تولید و ترشح پروتئینهای نوترکیب تبدیل ساختهاست .[10] فنوتیپ طبیعی و اصلی مخمر پیکیاپاستوریس MUT+ میباشد. سویههای حاوی این نوع فنوتیپ دارای هر دو ژن رمزکنندهی پروموترهای AOX1 و AOX2 میباشند. در این گروه متانول به میزان بالا و به صورت سریع استفاده میشود .[11] کشت مخمر پیکیاپاستوریس طی دو مرحله انجام میگیرد.
در مرحله اول، سلولها در محیط کشتی به نام Batch - حاوی یک منبع کربن غیرقابل تخمیر نظیر گلیسرول - رشد می-کنند و در مرحله دوم از یک محیطکشت القایی برای تحریک پروموتر AOX و استفاده از منبع کربن قابل تخمیر - متانول - برای بیان ژن و القای پروتئین نوترکیب استفاده میشود. این محیطکشت Fed- Batch نامیده میشود 5]،13،.[12
.2 مواد و روش ها
با انتخاب سویه GS115 وفنوتیپ mut+ فرآیند بیان انجام شد که البته قبل آن نیاز به ساخت محیط کشت است.100میکرولیتر از کلنی شماره - GS115,PIC9/FSH a,B - 11 به درون محیط کشت YEPD مایع زده شد و درون انکوباتور بادمای 30 و دور 200 rpm گذاشته شد. بعد از 24 ساعت فالکن رااز انکوباتور و پلیت YEPD-agar را از یخچال بیرون آورده وآنهارابه زیر هود منتقل کرده و لوپ استریل را بعد از سرد شدن آن، داخل YEPD مایع برده وسر لوپ را با محلول آغشته نموده وروی پلیت کشت داده شد, سپس پلیت را در انکوباتور با دمای 30 درجه و با دور 250 rpm به مدت سه روزگذاشتیم.
.1,2 فرآیند بیان
کشت کلنیهای نوترکیب مخمر پیکیاپاستوریس در محیط کشت :BMGY درون 6 تا فالکن مقدار 5 سی سی محیط BMGY ریخته شد. سپس ازپلیت YEPD جامد تک کلنی برداشته شد و درون فالکن ها زده شد و به مدت 12-18 ساعت در دمای 30°c با دور 200 rpm انکوبه شد. دراین محیط به دلیل حضور گلیسرول ژن الکل اکسیداز 1 غیر فعال باقی می ماند که در حقیقت این مرحله برای تولید بیوماس سلولی انجام می گیرد.
انتقال از محیط کشت BMGY به BMMY به منظور تحریک بیان و ترشح پروتئین، مخمرهای رشدیافته به محیط کشت بیانی منتقل شدند. برای این کار ابتدا نمونههای مخمری رشدیافته در محیط کشت BMGY با دور 4500 g در دمای 22œc بهمدت 5 دقیقه سانتریفوژ شدند. پس از جداسازی رسوب - سلولها - از مایع رویی محیطکشت، رسوب ها در 1سی سی BMMY حل شده و به 3 تا ارلن و3 تا بافل فلاسک حاوی این محیط ریخته شد. حجم نهایی 25 cc محیطکشت BMMY در دمای 30œc با دور 250rpm انکوبه شدند - متانول درترکیب محیط است.زمان صفر - افزودن متانول به محیط کشت هر24 ساعت که در نهایت ./5 حجم محیط کشت است.
نمونهگیری از محیط کشت مخمر پیکیاپاستوریس در زمان72 ساعت بهمنظور بررسی ترشح پروتئین در محیط کشت و دستیابی به مدت زمان بهینه بیان ژن پس از القا با متانول ، نمونهگیری از محیط کشت در ساعت مشخصی انجام شد. ابتدا در لحظه آغازین انتقال سلولها به محیط کشت بیانی و پس از آن در 72 ساعت پس از قرارگیری در محیط کشت بیانی، محیطکشت جمع آوری شد.
سپس نمونهها بهمدت 5دقیقه با دور 5000 rpm در دمای معمولی سانتریفوژ شده و مایع رویی که حاوی پروتئین مورد نظر است از سلولهای مخمری جداسازی و هر یک در فریزر -20œc نگهداری شد. بهمنظور در دسترس قراردادن کربن مورد نیاز جهت فعالسازی آغازگر AOX و در نهایت تحریک بیان ژن، هر 24 ساعت حجمی از متانول مطلق به حجم باقیمانده از محیط کشتBMMY اضافه گردید، بطوری که غلظت نهایی متانول در کل محیط کشت در حدود 0/5 درصد بدست آید. برای جلوگیری از خطای آزمایش 3 بار تکرار داشتیم.
تغلیظ پروتئین با روش 4/14 :TCA گرم تری کلرواستیک اسید - - TCA درون 10 میکرولیتر آب حل کرده و 1 CC نمونه پروتئین و 250 میکرولیتر از TCA را باهم مخلوط کرده و 10 دقیقه روی یخ انکوبه شد و سپس با دور 14000rpm ، دمای 4 œc و مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد و مایع رویی را دور ریخته و رسوب آن را با 200 میکرولیتر استون شستشو داده - 2بار - و در نهایت رسوب آنرا در دمای محیط خشک کرده و 40 میکرولیتر از buffer 2x sample را به نمونه ها زده وجوشانده شد. جداسازی با ژل پلی اکریل آمید%15انجام شد وژلها رنگ آمیزی شدند.
.2,2 بررسی بیان پروتئین FSH گاوی نوترکیب در ظرف کشت متفاوت با روش SDS-PAGE تکنیک SDS-PAGE، یا الکتروفورز ژل پلیاکریلآمید ، یکی از روشهای قدرتمند جداسازی پروتئینها براساس وزن ملکولی میباشد. با حضور جریان الکتریکی، پروتئینهای دارای بار منفی بهسمت الکترود مثبت حرکت میکنند. رنگ آمیزی با نیترات نقره با دستور زیر صورت گرفت.
رنگ آمیزی با نیترات نقره:
مرحله :1
بعد از جدا کردن ژل آن را درون محلولی که شرح آن در جدول 1 آمده،انداخته شد و درب ظرف گذاشته و یک شبانه روز صبر می کنیم.
