بخشی از مقاله
چکیده
در این پژوهش به منظور شناسایی گونه های قارچی عامل کاندیدیازیس، 100 نمونه ترشحی از افراد مراجعه کننده به بیمارستان تامین اجتماعی سنندج جمع آوری شد و پس از تشخیص میکروسکوپی و همچنین تشخیص بر پایه محیط های کشت میزان شیوع این قارچ در افراد مراجعه کننده مورد بررسی قرار داده شد و سپس با استفاده از تکنیک واکنش تکثیر زنجیره پلی مراز بر پایه نواحی ژنی ITS و استفاده از آنزیم های برشی بر محصول تکثیر شده میزان حضور گونه های مختلف شناسایی گردید.
نتایچ حاصل از این پژوهش نشان می دهد که قارچ Candida albicans بیشترین میزان شیوع را در بین افراد بیمار با میزان 86 درصد از خود نشان می دهد و همچنین گونه های C. parapsilosis و C. grabrata به ترتیب با نرخ شیوع 11 درصد و 3 درصد نیز در بین نمونه های مورد بررسی شناسایی شدند. استفاده از تکنیک واکنش زنجیره پلی مراز می تواند به عنوان یک ابزار مفید، کارآمد، سریع و ارزان قیمت در مقایسه با روش های بر پایه کشت، برای شناسایی این گونه ها جایگزین شده و مورد استفاده قرار داده شود.
مقدمه
قارچ کاندیدا آلبیکنس با نام علمی Candida albicans یک قارچ دیپلوئید میباشد که به عنوان مخمر و یا سلولهای تاژکدار رشد کرده و عامل اصلی بیماریهای عفونتهای واژن و دیگر عفونتهای فرصت طلب در انسانها است .[1] این قارچ از ارگانیسمهای ساپروفیت و همزیست بوده و جز میکروارگانیسمهای فلور میکروبی بدن انسان است و به طور طبیعی با انسان به صورت مسالمت آمیز زندگی کرده و ایجاد بیماری نمیکند .[2]
به هم خوردن تعادل فلور میکروبی بدن سبب رشد بی رویه این قارچ شده و باعث ایجاد عفونت از جمله بیماری کاندیدیازیس واژن می شود. کلون سازی این قارچ و سویههای آن در طی دوران بارداری در زنان در واژن افزایش دارد و نتایج نشان میدهد که حضور این گونه در طی دوران بارداری در زنان بدون نشانه میباشد. مشخص شده است که واژن در زنان یک نقش کلیدی را در توسعه جامعه میکروبی جنین بازی میکند و بسیاری از مطالعات همکاری بین کلون سازی میکروبی واژن و آلودگی میکروبی جنین را نشان دادهاند .[3]
تا کنون بیش از 200 گونه از قارچ Candida شناسایی شده است. بعضی از گونه های شناخته شده این قارچ جزو فلور میکروبی بدن انسان به شمار رفته که در پوست، فلور دستگاه گوارشی و همچنین دستگاه تنفسی حضور دارند. اما در این میان تنها 10 درصد گونه های شناخته شده از این قارچ توانایی ایجاد بیماری برای انسان را دارد که پنج گونه برتر این قارچ در رابطه با ایجاد عفونت و بیماری برای انسان می تواند به Candida albicans، C. glabrata، C. parapsilosis، C. tropicalis و C. krusei اشاره نمود که این پنج گونه 95 تا 97 درصد بیماری های انسانی در رابطه با این قارچ بیماری زا را شامل می شوند که بیماری اصلی رایج حاصله از این قارچ کاندیدیاز - عفونت حاصل شده از گونه های قارچ - Candida نام دارد .[4]
حالت نرمال بهداشت واژن عملکرد بسیار گسترده ای را بر اساس جامعه میکروبی خود دارد که در حقیقت این جامعه میکروبی خط اولیه دفاع برای بدن محسوب می گردد. بر همین اساس با وجود اینکه مکانیسم دفاعی واژن به همراه جامعه میکروبی خود توزیع مشخصی را دارد، هر گونه تغییراتی در تعادل نرمال آن می تواند باعث بروز نشانه های عفونت و بیماری و یا افزایش میزان تخلیه، تورم و حتی خارش ناشی از عفونت در این اندام گردد.
بر همین اساس هر گونه نشانه بیماری ایجاد شده در واژن توسط التهاب و یا عفونت واژینیتیس نام دارد که یکی از بیماری های بسیار رایج برای خانم ها در سنین بارداری در تمامی جهان است که می تواند تاثیرات نامطلوب خود را نیز به کودکان در بدو تولد انتقال دهد .[5] بر همین اساس، یکی از عوامل بسیار رایج ایجاد واژیناتیس، باکتری های ایجاد کننده آن و قارچ Candida albicans است. شیوع واژینوسیس باکتریایی در بعضی کشور ها از جمله سوئد در حدود 10 تا 20 درصد گزارش شده است و تقریبا 75 درصد تمامی خانم ها در طول عمر خود حداقل یک مرتبه به علت عفونت قارچی ایجاد شده دچار می شوند .[6]
جداسازی بعضی از گونه های میکروبی کاری بسیار طاقت فرسا بوده و یا رشد بسیار آهسته و کندی را بر روی محیط های کشت نشان می دهند و حقیقتا شناسایی دقیق بعضی از عوامل میکروبی با استفاده از روش های کشت امکان پذیر نمی باشد. روش های تشخیصی مولکولی همانند PCR - تکثیر زنجیره پلی مراز - برای شناسایی عفونت های میکروبی و تشخیص آنها تا کنون به صورت گسترده ای توسعه داده شده است و بر خلاف روش های مبتی بر محیط کشت، بیشتر روش های برآورد مولکولی بر اساس ماده ژنتیکی ارگانیسم مورد هدف طراحی و اجرا می گردند .[7]
در همین راستا هدف این پژوهش توسعه یک روش تکثیر زنجیره پلی مراز برای تشخیص رایج ترین نوع قارچ عامل کاندیدیازیس واژن با استفاده از روش های مولکولی می باشد. این پژوهش با توجه به شرایط ناحیه ای و استفاده از آغاز گر های اختصاصی طراحی شده برای گونه مورد نظر و شناسایی آن با استفاده از آنزیم های برشی است.
ناحیه ITS به صورت فراوانی در DNA قارچ ها برای بررسی اکولوژی مولکولی آنها توالی یابی شده است و به عنوان یک توالی بین المللی به عنوان یک توالی بارکد پیشنهاد می گردد .[8] این توالی نوعا برای بررسی سیستماتیک مولکولی در سطح گونه ای و بین گونه ای - برای شناسایی نرخ ژئوگرافیکی - کاربرد دارد چرا که تنوعات بالایی از تنوعات را از دیگر نواحی ژنتیکی rDNA در بر دارد - برای زیر واحد های کوچک و بزرگ - rRNA و تنوعات در بین توالی های تکراری rDNA گاهی اوقات در نواحی های ITS و IGS قابل مشاهده است. به علاوه آغازگر های استاندارد ITS1+ITS4 به صورت استاندارد در بیشتر مطالعات آزمایشگاهی مورد استفاده قرار می گیرد .[9]
مواد و روش ها
سواپ های نمونه گیری شده به منظور کشت اولیه میکروبی در زیر هود لامینار بر روی محیط های جامد سابورد دکستروز آگار - SDA - تماس داده شد و پس از بستن درب های پتری دیش، با استفاده از پارافیلم محکم بسته شد و به مدت 2 روز در دمای 37 درجه سانتی گراد در اکوباتور قرار داده شد. به منظور انجام کشت افتراقی برای جداسازی گونه های قارچی موجود در نمونه ها، پس از دو روز نمونه ها از انکوباتور برداشته شده و پس از نمونه گیری مجدد بر روی محیط کشت کروم آگار محتوی کلرآمفنیکل کاندیدا تماس داده شد و مجددا به مدت 48 ساعت در دمای 35 درجه سانتی گراد انکوبه سازی گردید.
به منظور طراحی آغازگر های مورد استفاده در این پژوهش توالی ITS1 و ITS4 از پایگاه داده NCBI از قارچ C. albicans گرفته شده و آغازگر مستقیم و معکوس برای تکثیر اینترون های ITS1 و ITS2 مورد استفاده قرار داده شد. به منظور طراحی آغازگرها توالی دریافت شده از پایگاه داده با کد دسترسی با فرمت FASTA دریافت و به نرم افزار تحت وب Primer 3 Plus انتقال داده شد که برای تکثیر ناحیه 690 جفت بازی مورد طراحی قرار گرفت. اطلاعات آغاز گر های مورد استفاده در جدول 1 نشان داده شده است.
آغاز گر های طراحی شده ب منظور صحت عملکرد در نرم افزار تحت وب Oligo Calc نیز مورد بررسی قرار داده شدند و در شرکت Bioneer کره جنوبی سنتز گردیدند. همچنین آغازگر های مورد استفاده به منظور بررسی ناحیه قرار گیری با توالی ITS1+ITS4 با استفاده از روش هم ردیف سازی و با استفاده از نرم افزار تحت وب ClustalW omega مورد بررسی قرار داده شدند تا از صحت ناحیه تکثیری اینترون های ITS1 و ITS2 اطمینان حاصل شود.
