بخشی از مقاله
چکیده
گیاه قرهقاط عضوی از خانوادهی اریکاسه میباشد. برگ، ریشه و میوه این گیاه دارای اثرات دارویی هستند. ریزازدیادی یا تکثیر از طریق کشت درونشیشهای روشی کارآمد و موثری را برای ازدیاد سریع گیاهان به ویژه تولید گیاهان عاری از عوامل بیماریزای قارچی، باکتریایی و ویروسی را فراهم میکند. این تحقیق به منظور بررسی تأثیر نوع محیط کشت پایه و تنظیم کنندههای رشد گیاهی مختلف و همچنین تأثیر بنومیل درون محیطهای کشت، بر رشد ریزنمونههای قرهقاط در شرایط کشت درونشیشهای انجام گردید. برای این منظور، ریزنمونههای تکگرهی و جوانههای انتهایی قرهقاط از مناطق جنگلی استان اردبیل تهیه و سپس به حالت معمول ابتدا با محلول ظرفشویی به مدت 30 دقیقه شستشو داده شده و سپس زیر آب جاری به مدت یک ساعت آبکشی شدند، محلول - 5% - H2O2، اتانول %70 و در نهایت محلول هیپوکلریتسدیم 2%/5 با pH= 10 به مدت 12 دقیقه ضدعفونی شدند. ریزنمونهها روی محیط کشتهای MS، WPM و AN حاوی IBA 0/1 mg/l و سطوح مختلف زآتین، BAP و TDZ کشت شدند. نتایج نشان داد که بین محیط کشتهای پایه و ترکیبات هورمونی و همچنین بنومیل - غلظت 150 میلی گرم برلیتر - از نظر تعداد برگ، درصد برگدهی و درصد زندهمانی ریزنمونهها اختلاف معنیداری وجود دارد. به طوریکه بیشترین تعداد برگ مربوط به محیط کشت MS حاوی 0/5 میلی گرم برلیتر BAP و 0/1 میلی گرم برلیتر IBA فاقد بنومیل و همچنین از نظر درصد برگ دهی و درصد زندهمانی ریزنمونهها مربوط به اکثر محیط کشتهای AN و WPM فاقد بنومیل است. به طور کلی وجود بنومیل درون محیط کشت تأثیر منفی بر رشد ریزنمونهها و به خصوص درصد برگدهی و درصد زندهمانی ریزنمونه ها داشت.
کلمات کلیدی: قرهقاط، بنومیل، BAP، زآتین و TDZ
-1 مقدمه
گیاه قرهقاط - Vaccinium arctostaphylos - عضوی از خانوادهی اریکاسه1میباشد. برگ، ریشه و میوه این گیاه دارای اثرات دارویی هستند، ولی مهمترین مصرف دارویی، مربوط به میوهی آن میباشد - آخوندزاده، . - 1379 به خاطر افزایش تقاضا، مطالعات وسیعی در زمینه بهنژادی، افزایش کمی و کیفی محصول و سیستمهای کاشت آغاز شده است. از جمله روشهایی که برای تکثیر گونهی V. arctostaphylos میتواند مورد استفاده قرار گیرد، ریزازدیادی یا تکثیر از طریق کشت درونشیشهای میباشد، که روشی کارآمد و موثری را برای ازدیاد سریع گیاهان به ویژه تولید گیاهان عاری از عوامل بیماریزای قارچی، باکتریایی و ویروسی را فراهم میکند . - Debnath & McRae, 2002 - مؤثرترین سیستم تکثیری برای انواع گونههای جدید و قدیم گیاهان قرهقاط استفاده از ریزازدیادی است، چون به حد کافی گیاهانی با رشد سریع تولید میکنند و همچنین امکان تولید نهالهایی عاری از بیماری در این روش وجود دارد که در روشهای سنتی تولید گیاهان عاری از بیماری محال است. در مقایسه با تکثیر معمولی - تکثیر غیرکشتبافتی - ، گیاهان قرهقاط حاصل از ریزازدیادی درونشیشهای میوههای بیشتری تولید می-کنند . - ElShiekh et al., 1996 - بروز آلودگیهای میکروبی چالش اصلی برای انجام کشت درونشیشهای و تکثیر گیاهان به ویژه گیاهان چوبی با استفاده از کشت بافت و اندام میباشد. زمانی که از ریزنمونههای رشد یافته در شرایط طبیعی برای کشت درونشیشهای استفاده شود کنترل آلودگی آن بویژه آلودگیهای درونی اهمیت بسیاری پیدا میکند. به طوری که اگر برای مقابله با این بیماریها راهکارهای مناسبی به کار گرفته نشود به صورت آلودگیهای قارچی و باکتریایی بروز پیدا کرده و کل ریزنمونهها را از بین میبرد . - Reed et al., 1998 - استفاده بیش از حد از آنتی بیوتیکها و آنتی میکروبها برای جلوگیری از بیماری، منجر به کاهش رشد گیاه و تقویت اندامهای سخت درون گیاهی میشود. بنومیل یک قارچکش سیستماتیک بوده که در اکثر مواقع برای مبارزه علیه قارچهای گونههای فوزاریوم مورد استفاده قرار میگیرد . - Leifert et al., 1998 - بنومیل در حالت محلول دو ترکیب مهم methyl-2-benzimidazolacarbanat و butyl isocyanate را تولید می-کند که روی مسیر تنفسی و انرژیزایی سلولهای قارچ اثر میگذارد. استفاده از غلظتهای بالا برای ضدعفونی ریزنمونهها میتواند روی ریزنمونه نیز اثر منفی بگذارد . - Pence, 2005 - استفاده از پیش تیمار بنومیل به دلیل خاصیت سیستماتیکی امکان کاهش درصد آلودگی آنها گشته ولی این امر بستگی زیادی به غلظت بنومیل درون محیط کشت و مدت زمان غوطهوری ریزنمونهها در آن دارد به گونهای که در غلظت بالا و مدت زمان طولانیتر به همان نسبت که میزان آلودگی کاهش مییابد، میزان زندهمانی و رشد ریزنمونهها به تأخیر افتاده و یا از بین می-رود . - Mitchell et al., 2003 - بنابراین، این تحقیق به منظور بررسی تأثیر بنومیل در کنار انواع محیط کشت به همراه ترکیبات هورمونی مختلف بر روی حذف آلودگیهای
میکروبی و رشد ریزنمونههای گرهی گیاه انجام گردید.
-2مواد و روشها
ریزنمونههای تکگرهی و جوانههای انتهایی قرهقاط از مناطق جنگلی استان اردبیل تهیه شد و به حالت معمول ابتدا با محلول ظرفشویی به مدت 30 دقیقه شستشو داده شده و زیر آب جاری به مدت یک ساعت آبکشی شدند. سپس با محلول 5% H 2O2 به مدت 10 دقیقه غوطه-ور شده و پس از آن با آب استریل به مدت 2 دقیقه شستشو داده شدند - این مرحله به دلیل ترکیب پذیری بالای H2O2 و هیپوکلریت سدیم و تأثیر مخرب بر روی سلول گیاهی الزامی است - . سپس ریزنمونهها با اتانول %70 به مدت 50 ثانیه و هیپوکلریتسدیم با pH =10 و حاوی 0%/1 Tween20 به مدت زمان 12 دقیقه، تیمار شده و پس از سه بار آبکشی با آب مقطر استریل روی محیط کشت پایه MS، AN و WPM حاوی صفر یا 150 میلیگرم بر لیتر بنومیل، 0/1 میلیگرم بر لیتر IBA و 0/5، 1 و 2 میلیگرم بر لیتر زآتین، BAP و TDZ کشت شدند. 4 هفته پس از کشت درصد زندهمانی ریزنمونهها، درصد برگدهی ریزنمونههای و تعداد برگ در ریزنمونه ثبت گردید. همچنین تعداد ساقه و اندازهی آن به صورت کیفی ثبت شدند از محیطهای پایه فاقد تنظیم کنندههای رشد گیاهی به عنوان شاهد استفاده گردید. آزمایش به صورت فاکتوریل برپایه طرح کاملا تصادفی با سه تکرار و حداقل 10 ریزنمونه در هر تکرار انجام گرفت. همچنین در سه تکرار و حداقل 10 لوله آزمایشی در هر تکرار انجام گرفت. قبل از انجام تجزیه و تحلیل دادهها، تست نرمال بودن دادهها با استفاده از آزمون تک نمونهایی کولوگروف-اسمیرنوف انجام گرفت. تجزیه و تحلیل دادهها با استفاده از نرمافزار SPSS16 و رسم نمودارها با استفاده از نرمافزار EXCEL انجام گرفت.
-3نتایج
طبق نتایج به دست آمده از جدول تجزیهی واریانس، درصد زندهمانی و برگدهی ریزنمونههای قرهقاط به طور معنیداری تحت تأثیر نوع محیط کشت پایه، غلظت بنومیل درون محیط کشت و ترکیب هورمونی و همچنین اثرات متقابل دو جانبه و سه جانبه بین آنها قرار دارد. ولی میانگین تعداد برگ در هر ریزنمونه فقط تحت تأثیر ترکیب هورمونی محیط کشت و اثر متقابل بین ترکیب هورمونی و نوع محیط کشت پایه قرار گرفت. نتایج حاصل از مقایسهی میانگین ترکیب تیماری محیط کشت پایه و غلظت 150 میلیگرم بر لیتر بنومیل از نظر میانگین تعداد برگ بین محیط کشتهای حاوی بنومیل و بدون بنومیل کمترین تعداد برگ مربوط به محیط کشت AN بود، و بین سایر تیمارهای محیط کشت و غلظت بنومیل اختلاف معنی داری وجود نداشت - جدول . - 1 بیشترین درصد برگدهی مربوط به محیط کشت 61/96 - AN درصد - بود. همچنین بیشترین درصد زندهمانی ریزنمونههای قرهقاط 78/91 - و 74/10 درصد - به ترتیب مربوط به محیط کشت AN و WPM فاقد بنومیل بود - جدول. - 1 همانطوریکه در جدول 1 مشاهده میشود افزودن 150 میلی گرم بر لیتر بنومیل به ترکیب محیط کشت درصد زندهمانی ریزنمونهها و درصد ریزنمونههای رشد کرده در محیط کشت AN و WPM را به طور معنیداری کاهش داده است. علاوه براین، بین محیط کشتهای پایه MS، AN و WPM حاوی 150 میلیگرم بر لیتر بنومیل از نظر میانگین تعداد برگ در هر ریزنمونه اختلاف معنیداری وجود نداشت ولی در محیطهای پایه بدون بنومیل، میانگین تعداد برگ در هر ریزنمونه در محیط کشت اندرسون - AN - به طور معنی داری کمتر از MS بود. در حالیکه در محیط کشت AN فاقد بنومیل درصد برگدهی و در محیط کشت AN و WPM فاقد بنومیل درصد زندهمانی ریزنمونهها به طور معنیداری افزایش یافته است - جدول - 1 که این امر ناشی از اثر متقابل بین این دو عامل - محیط کشت پایه و بنومیل - است.
جدول :1 تأثیر نوع محیط کشت پایه، غلظت بنومیل درون محیط کشت بر استقرار و رشد ریزنمونههای قرهقاط
