بخشی از مقاله
چکیده
آنالیز کامپیوتری اسپرم - CASA - برای ارزیابی مورفومتریک اسپرم ها نیز استفاده می شود ولی نتایج آن در هر گونه بستگی به روش رنگ آمیزی مورد استفاده دارد. هدف از تحقیق حاضر ارزیابی تاثیر روش رنگ آمیزی اسپرم برروی ابعاد سر آن در مورفومتری اسپرم گاومیش با استفاده از روش CASA بود. نمونه های منی مورد استفاده برای ارزیابی تاثیر روش رنگ آمیزی - دیفکوییک و هماتوکسیلین - برروی ابعاد سر اسپرم از سه راس گاومیش بارور جمع آوری گردید . یک قطره از نمونه منی در PBS رقیق شده و برای تهیه گسترش مورد استفاده قرار گرفت. لام ها به دو روش Diff-Quick و هماتوکسیلین رنگ آمیزی شدند. از هر نمونه و لام رنگ آمیزی شده 100 اسپرم توسط نرم افزار CASA مورد شناسایی و آنالیز قرار گرفتند. بر اساس نتایج بدست آمده روش رنگ آمیزی بطور معنی داری ابعاد سر اسپرم را تحت تاثیر قرار داد. طول و عرض سر در اسپرم های رنگ آمیزی شده با - Diff-Quick به ترتیب 7/97 و 4/63 میکرومتر - بطور معنی داری بیشتر از اسپرم های رنگ آمیزی شده با هماتوکسیلین - به ترتیب 7/41 و 4/45 میکرومتر - بود . - p<0.05 - بر اساس نتایج این تحقیق میانگین ابعاد سر اسپرم گاومیش تحت تاثیر روش های رنگ آمیزی قرار دارد.
کلمات کلیدی : مورفومتری اسپرم- روش رنگ آمیزی- گاومیش- CASA
مقدمه
ارزیابی کیفیت اسپرم در پیشگوئی باروری نمونه های منی مفید بوده و همچنین ابزاری در تشخیص بیماری بالینی حیوانات کم بارور می باشد.روش های ارزیابی متداول بر اساس ارزیابی های ذهنی فراسنجه های منی مانند قدرت حرکت، مورفولوژی - ریخت شناسی - ، مقدار یا غلظت منی بوده است.ریخت شناسی منی کم قوت - ضعیف - یک نشانگر مهمی از کاهش یافتن باروری در بزها ، نریان، گاوهای نر و انسان گزارش شده است.با این وجود، ارزیابی ذهنی اسپرم بر اساس مشاهده، نوسانات شدیدی در نتایج بین آزمایشگاه ها و تکنسین ها فراهم کرده است. - - 2 این نوسانات تفسیر دقیق نتایج را مشکل ساخته و نیاز به تکنیک های غیر ذهنی و دقیق را ضروری می سازد.سامانه آنالیزگر مورفومتری اسپرم به کمک کامپیوتر - ASMA - که در طی سالهای اخیر معرفی شده است، به عنوان روشی برای غلبه بر مشکل مورفومتری ذهنی اسپرم ها می باشد.گرچه این تکنیک در اصل و در ابتدا برای اسپرم انسان طراحی شده بود، به طور پیشرونده ای در برخی از گونه های حیوانی نیز بکار رفته است. برای افزایش دقت CASA در هر کدام از گونه های حیوانی بایستی استاندارد سازی متغیرهایی مانند روشهای رنگ آمیزی و آماده سازی نمونه تعیین گردد. رنگ آمیزی اسپرم باعث ایجاد کنتراست کافی اسپرم با زمینه لام شده و شناسایی آنرا امکان پذیر می سازدروشهای رنگ آمیزی مختلفی برای مورفومتری کامپیوتری اسپرم استفاده شده اند. دیفکوئیک و هماتوکسیلین در انسان و حیوانات مختلف نتایج مناسبی را برای مورفومتری توسط ASMA نشان داده اند - . - 5 هدف از این آزمایش، تاثیر روش های رنگ آمیزی و مقایسه مورفومتری سر اسپرم توسط CASA بود.
مواد و روش ها
جمع آوری منی و آماده سازی نمونه: این آزمایش در مرکز اصلاح نژاد گاومیش شمال غرب کشور واقع در 20 کیلومتری غرب ارومیه انجام گرفت.در این مطالعه از 3 راس گاومیش نر که حیوانات تحت شرایط یکسان تغذیه ای، محیطی و نوری نگهداری می شدند استفاده شد. برای جمع آوری نمونه های منی از یک راس گاومیش ماده فحل و واژن مصنوعی استفاده گردید.بلافاصله بعداز جمع آوری اسپرم ، حجم منی بوسیله استوانه مدرج و تحرک اسپرم ها توسط میکروسکوپ سه چشمی - OlympusCX21 - مجهز به دوربین فیلمبرداری متصل به کامپیوتر - - SamsungSDC-313B اندازه گیری شد، نمونه هایی که دارای قابلیت تحرک خوب بودند انتخاب شده و به داخل بن ماری با دمای 37 درجه سانتی گراد منتقل شدند. 80 میکرولیتر از هر نمونه ی منی در 1 میلی لیتر محلول PBS رقیق شده و سپس 5 میکرو لیتر از نمونه رقیق شده روی سطح شفاف لام هایی که قبلا با الکل 70 درصد شسته شده بودند، گسترش تهیه شده وبه قطره های منی یک روز کامل فرصت داده شد تا در هوای آزاد خشک شوند. سپس طبق جدول 1 نسبت به رنگ آمیزی آنها به روش هماتوکسیلین و Diff-Quick اقدام گردید.
آنالیز مورفومتریک: آنالیز مورفومتریک سرهای اسپرم توسط مدل مورفولوژیکی SCA انجام شد. در این سیستم تصویر اسپرم ها از طریق دوربین متصل به میکروسکوپ، با بزرگنمایی 100 X توسط روغن ایمرسون مشاهده شدند و سپس توسط نرم افزار مربوطه ابعاد مختلف اسپرم محاسبه شده و داده ها به کامپیوتر انتقال یافتند.پارامتر های محاسبه شده توسط CASA بین دو روش رنگ آمیزی مقایسه گردید.آزمایش به صورت طرح فاکتوریل در قالب بلوک کامل تصادفی در 3 تکرار انجام شد.برای آنالیز آماری از نرم افزار SAS و رویه GLM استفاده شده است.
نتایج
در این مطالعه از 8 انزال جمعآوری شده از سه راس گاومیش نر با هر روش رنگآمیزی در مجموع 4800 اسپرم مورفومتری گردید. نتایج آنالیز واریانس تاثیر روش رنگ آمیزی برروی پارامترهای اندازه گیری شده توسط CASA در جدول 2 مشاهده میشود. تاثیر نوع رنگآمیزی بجز میزان کشیدگی سر در سایر متغییرهای مورفولوژیک معنی دار بود. در اسپرمهای رنگآمیزی شده با هماتوکسیلین نسبت به انواع رنگآمیزی شده با دیفکوییک میانگین طول و عرض سر بطور معنیداری - - P<0.05 کمتر بود
- جدول . - 3 میزان عدم تقارن و بیضوی بودن در اسپرم های رنگآمیزی شده با Diff-Quick بیشتر از اسپرم های رنگ آمیزی شده با هماتوکسیلین بود.
بحث
برای اینکه نرم افزار ASMA بتواند حدود اسپرم را شناسایی کرده و سپس ابعاد آن را محاسبه کند، بایستی از روش رنگ آمیزی مناسبی استفاده کرد. رنگ آمیزی اسپرم باعث ایجاد کنتراست کافی آن با زمینه لام شده و شناسایی آن را امکان پذیر می سازد. روش های رنگ آمیزی مختلفی برای مورفومتری کامپیوتری اسپرم استفاده شده اند Diff-Quick و هماتوکسیلین در انسان و حیوانات مختلف نتایج مناسبی را برای مورفومتری توسط ASMA نشان داده است 8 - و. - 5 در مطالعه حاضر دقت ASMA برای تشخیص درست اسپرم ها در هر دو روش رنگ آمیزی مطلوب بود. میزان خطای رقومی کردن - درست تشخیص دادن حدود اسپرم توسط سیستم - در هر دو روش رنگ آمیزی کمتر از %10 بود. نتایج این تحقیق نشان می دهد ارزیابی اسپرم گاومیش توسط CASA به طور معنی داری تحت تاثیر نوع رنگ آمیزی قراردارد . ابعاد سر اسپرم در موارد رنگ آمیزی شده با Diff-Quick بطور معنی داری بزرگتر از اسپرم های رنگ آمیزی شده با هماتوکسیلین بود. Hidalgo و همکاران - 2006 - نیز در مطالعه ای برروی مورفومتری اسپرم بز نتایج مشابهی را گزارش کردند. در این تحقیق که از سه روش رنگ آمیزی استفاده شده بود، اثر نوع رنگ آمیزی برروی ابعاد اسپرم معنی دار بود و در اسپرم های رنگ آمیزی شده با Diff-Quick بزرگتر از هماتوکسیلین و هماکلر بود. در مطالعه انجام گرفته توسط Hidalgo و همکاران - 2005 - در اسب نیز اسپرم های رنگ آمیزی شده با Diff-Quick ابعاد بزرگ تری نسبت به اسپرم های رنگ آمیزی شده با هماتوکسیلین و هماکلر داشتند . Soler و همکاران - 2005 - در مطالعه ای برروی اسپرم های جمع آوری شده از اپیدیدیم گوزن قرمز اثر سه نوع رنگ آمیزی را برروی موفومتری اسپرم توسط سیستم آنالیز کامپیوتری ارزیابی کردند.ابعاد سر اسپرم های رنگ آمیزی شده با Diff-Quick بطور معنی داری کوچکتر از موارد رنگ آمیزی شده با هماتوکسیلین بود، هرچند مقدار این اختلاف زیاد نبود . علت این نتایج متفاوت علاوه بر اختلاف گونه ای، می تواند ناشی از انجماد نیز باشد. - - 3 متفاوت بودن ابعاد سر اسپرم های رنگ آمیزی با روش های مختلف می تواند ناشی از تفاوت در روش های فیکس کردن و نیز یکسان نبودن چگونگی تاثیر رنگ های مختلف برروی اسپرم باشد. خشک کردن و فیکس کردن به عنوان عوامل موثر بر ابعاد سر اسپرم شناخته شده اند - . - 7 کاهش حدود %15 در ابعاد طول و عرض اسپرم در انسان - - 6 و کاهش 20 درصدی طول و 13 درصدی عرض اسپرم در نریان - - 1گزارش شده است.بطورکلی بر اساس نتایج این تحقیق هماتوکسیلین و Diff-Quick روش های رنگ آمیزی مناسبی برای مورفومتری اسپرم گاومیش توسط CASA می باشند و نوع روش رنگ آمیزی تاثیر معنی داری در مورفومتری اسپرم دارد.
