بخشی از مقاله
انتخاب جنس فرزند با جداسازي اسپرم به روش گرادیان آلبومین در سیکلهاي تلقیح داخل رحمی اسپرم
زمینه و هدف: از جمله دغدغههاي زوجین، بهخصوص در کشورهاي آسیایی، دستیابی به فرزند پسر میباشد. این خواسته معمولاً در زوجین بارور در مقایسه با افراد نابارور از شدت بیشتري برخوردار است. یکی از روشهاي نسبتاً ساده، ارزان قیمت و قابل انجام در مراکز ناباروري که نیازي به مواد شیمیایی سمی جهت جداسازي اسپرمهاي X و Y ندارد، روش اریکسون جهت جداسازي اسپرم با گرادیان آلبومین میباشد. لذا، هدف این مطالعه بررسی نتایج مربوط به انتخاب جنس نوزاد به روش جداسازي اسپرم با استفاده از روش اریکسون در افراد بارور و نابارور تحت درمان IUI بود.
روش بررسی: مطالعه از نوع توصیفی تحلیلی بود و نمونهها، 32 زوج 30) زوج بارور و 2 زوج نابارور) متقاضی تعیین جنسیت فرزند 31) زوج خواهان فرزند پسر و 1 زوج خواهان فرزند دختر) به روش اریکسون بودند. پس از بررسی اولیه نمونه اسپرم با استفاده از گرادیان آلبومین، اسپرمها طی کمتر از دو ساعت آماده شدند و با کاتتر ترانسفر مقدار 400-500μl محلول حاوي بیش از 10 میلیون اسپرم به حفره رحمی تزریق شد. تمام افراد کاندیدا، جهت انجام IUI، تحریک تخمکگذاري شده بودند. دادهها با نرم افزار SPSS و با استفاده از آزمون χ2، t و ناپارامتري ویلکاکسون محاسبه شد.
نتایج: از مجموع 32 زوج تحت مطالعه 30 زوج قبل از درمان داراي حداقل یک فرزند بودند. با جداسازي اسپرم به روش گرادیان آلبومین و IUI میزان بارداري %34/4 بود که از این میزان 4 مورد سقط شدند. میزان تولد %21/8 و دستیابی به جنس دلخواه در بین تولدها %71/4 بود. نتایج نشان داد که دو پارامتر تحرك پیشرونده تند، کند و نیز مرفولوژي طبیعی اسپرم بعد از جداسازي اسپرم با گرادیان آلبومین افزایش یافت (به ترتیب p<0/001، p<0/05 و .(p<0/05 در ضمن میزان تحرك پیشرونده و مورفولوژي طبیعی اسپرم در افرادي که صاحب فرزند پسر شدند، بیشتر از سایرین بود. فقط یک زوج خواهان فرزند دختر بودند که صاحب فرزند پسر شدند.
نتیجه گیري: روش گرادیان آلبومین که توسط اریکسون ابداع شد، روش بسیار مناسبی براي جداسازي اسپرمهاي X و Y و در نتیجه تعیین جنسیت پسر در زوجین بارور میباشد. کارایی این روش براي افراد نابارور نیاز به مطالعه وسیعتر دارد. در ضمن، روش گرادیان آلبومین به علت عدم استفاده از مواد شیمیایی سمی جهت جداسازي اسپرم و نیز عدم دستکاري جنین، روشی مطمئن میباشد.
کلید واژگان: انتخاب جنسیت، گرادیان آلبومین، تلقیح داخل رحمی اسپرم، اسپرم، تحرك اسپرم، مورفولوژي اسپرم
مقدمه
تاریخچه تعیین جنسیت فرزند پیش از بارداري به قرنها قبل برمیگردد. عوامل متعددي همچون مسائل فرهنگی، اجتماعی، مذهبی، اقتصادي و بالاخره طبی نظیر وجود بعضی از بیماريهاي وابسته به کروموزوم X زوجین را تشویق به انتخاب روشهاي سنتی یا درمانی جدید براي انتخاب جنسیت فرزند نموده است 2)،.(1
برقراري تعادل خانوادگی1 از جمله موارد دیگر انتخاب جنس فرزند میباشد. در سابق که کنترل جمعیت در کشور اجرا نمیگردید، اکثر خانوادهها پرجمعیت و معمولاً صاحب فرزند از هر دو جنس بودند. در صورتیکه اکنون و با اعمال سیاستهاي کنترل جمعیت و تعداد کم فرزندان، هرچند که در کل جامعه ممکن است نسبت پسر و دختر بهطور نسبتاً مساوي و متعادل باشد؛ اما، در خانوادهها این نسبت برقرار نبوده و اکثر خانوادهها داراي فرزندان دختر یا پسر (از یک جنس) هستند و این موضوع آزردگی آنها را به دنبال دارد. لذا، به نظر میرسد به کارگیري روشهایی که بتواند در این زمینه موثر باشد، به ارتقاء سلامت روانی جامعه کمک خواهد نمود.
اگرچه در وضعیت طبیعی، اسپرم در تعیین جنسیت نوزاد نقش دارد؛ ولی هنوز مشخص نیست که چه عواملی در انتخاب اسپرم حاوي کروموزوم X یا Y جهت باروري تخمک نقش دارند. Ericsson و همکاران اعتقاد دارند که اسپرمهاي حاوي کروموزوم Y به علت وزن کمتر فعالتر از اسپرمهاي حاوي کروموزوم X میباشند .(3) البته Rose و همکاران بر این باورند که علت این امر غنیسازي اسپرم با سلولهاي حاوي کروموزوم Y نیست و مکانیسم دیگري در این امر دخیل میباشد .(4) در مجموع در جوامع بشري، میزان مذکر به مونث تقریباً یکسان است. اما جوامع با نژادهاي متفاوت بهعلت تفاوتهاي ژنتیکی داراي میزان مذکر به مونث مختلف میباشند. براي مثال، سیاهپوستان بیش از سفیدپوستان داراي فرزند دختر میباشند .(5)
در حال حاضر، روشهاي متفاوت آزمایشگاهی براي تعیین جنسیت فرزند قبل از بارداري ابداع شده است که عبارتند از: روش تشخیص ژنتیکی قبل از لانه گزینی 2(PGD) که طی آن پس از تحریک تخمکگذاري، با استفاده از میکرواینجکشن، اسپرم بهداخل تخمک تزریق شده عمل لقاح صورت میگیرد. سپس با بیوپسی از جنین 6-8 سلولی یک بلاستومر را جدا نموده و با روش 3FISH یا روشهاي مولکولی جنس بلاستومر تعیین میشود و بعد از کشت، جنین با جنسیت مورد نظر به رحم منتقل میشود. روش فوق از حساسیت بالایی برخوردار است؛ ولی بسیار پرهزینه، داراي تکنیک پیچیده و شانس بارداري پایین میباشد .(6)
روش دیگر روش Microsort است که با استفاده از دستگاه فلوسیتومتري اسپرمهاي رنگآمیزي شده با ماده فلورسنت جدا شده و سپس اسپرمهاي حاوي کروموزوم مورد نظر از طریق 4 IUIبه رحم منتقل میشوند. این روش در حیوانات بهطور گسترده استفاده شده است .(6) اما به علت استفاده از رنگهاي فلورسنت از جمله رنگ هوخست و اشعه لیزر در روش میکروسورت، کاربرد آن در موارد انسانی انتقاد برانگیز شده است 8)،.(7 روش بعدي استفاده از گرادیان آلبومین5 است که شامل عبور دادن اسپرم از لایه هاي آلبومین انسانی است تا اسپرمهاي حاوي کروموزوم Y از اسپرمهاي X در دو لایه متفاوت از یکدیگر جدا شوند. لازم به ذکر است که کارایی این روش در تعیین جنسیت فرزند بارها توسط محققین مورد بحث قرار گرفته است. بعضی از مطالعات روش فوق را مورد تأیید قرار دادهاند 9)،8،(3 و برخی دیگر آن را ناموفق گزارش نمودهاند .(10-12) روش چهارم، روش ساده Modified Swim-up است که براساس حرکت اسپرم پایهگذاري شده است و طی چند مرحله انجام میگیرد .(13) گرچه، میزان موفقیت این روش در دستیابی به جنس پسر %89 و به جنس دختر %86 گزارش شده است؛ ولی دیگر محققین، نظر خاصی در مورد کارایی این تکنیک اعلام نکردهاند. تنها مورد گزارش شده جهت دستیابی به جنس مذکر با استفاده از روش اریکسون در ایران مربوط به تحقیق نصراصفهانی و همکاران میباشد .(14) آنها 45 زوج 21) زوج بارور و 24 زوج نابارور) را تحت درمان قرار دادند. نتایج نشان داد که دستیابی به جنس مورد نظر در گروه بارور %80 و در گروه نابارور %54/5 بود.
با توجه به موارد فوق و نیز تمایل به داشتن فرزند پسر در جوامع آسیایی از جمله ایران که گاهی به افزایش رشد جمعیت به علت بارداريهاي مکرر تا دستیابی به فرزند پسر و نیز عوارض روحی روانی و اقتصادي پیامد آن منجر میشود، این مطالعه تدوین گردید. هدف آن بررسی نتایج مربوط به انتخاب جنس نوزاد به روش جداسازي اسپرم با گرادیان آلبومین در افراد بارور و نابارور تحت درمان تلقیح داخل رحمی اسپرم (IUI) بود. با انجام این مطالعه به نظر میرسد کارایی این روش نسبتاً آسان، ارزان، غیرتهاجمی و قابل انجام با حداقل امکانات آزمایشگاهی را بتوان مورد ارزیابی قرار داد.
روش بررسی
افراد تحت مطالعه: در این مطالعه توصیفی تحلیلی از فروردین 85 تا خرداد 86، تعداد 32 مورد از زوجین متقاضی تعیین جنسیت به روش IUI و گرادیان آلبومین ارزیابی شدند. از بین این افراد، 31 زوج خواهان فرزند پسر و فقط یک زوج متقاضی فرزند دختر بودند. در ضمن، 30 زوج قبل از انجام IUI داراي حداقل یک فرزند بودند. بنابراین فقط دو زوج مشکل ناباروري داشتند.
به تمام افراد مشاوره لازم در خصوص روش کار، میزان موفقیت، موارد احتمال سقط و نیز هزینه درمان داده شد.
تحریک تخمک گذاري: پس از سونوگرافی اولیه، از روز سوم یا چهارم سیکل قاعدگی روزانه 2 آمپول hMG (Menogon , Ferring , Germany) تجویز شد. با بررسی اندازه فولیکول در سونوگرافی ترانس واژینال و رسیدن سایز اولین فولیکول به 18mm تزریق آمپول hMG قطع و آمپول (Daroupakhsh, Iran) hCG به میزان 10000IU تجویز گردید.
بررسی پارامترهاي اسپرم: نمونه مایع منی به روش خود تحریکی1 در داخل ظرف استریل یکبار مصرف جمعآوري و سپس، در دماي 37C براي مدت 15 دقیقه نگهداري گردید. وضعیت پارامترهاي ماکروسکوپی مایع سمینال شامل حجم، آگلوتیناسیون و قوام با استفاده از دستورالعمل سازمان بهداشت جهانی (WHO)، مشخص شد .(15) پس از آن با استفاده از وسیله Makler Chamber غلظت اسپرم، نوع و درصد تحرك آن مشخص گردید. براي بررسی مورفولوژي اسپرم و نیز غلظت سلولهاي گرد از رنگآمیزي گیمسا استفاده و تعداد 100 اسپرم به همراه سلولهاي غیراسپرمی پراکنده در بین آنها بررسی شد. سلولهاي لکوسیت نیز با توجه به دستورالعمل WHO به روش Endz شناسایی و میزان آن به صورت میلیون به ازاي هر میلیلیتر مایع منی گزارش شد.
روش گرادیان آلبومین: در یک لوله فالکون، مقدار 2-3ml مایع منی و هم حجم آن محیط Ham’s F10 (از قبل گرم شده) بدون آلبومین اضافه و پس از مخلوط نمودن با دور 2000rpm براي 10 دقیقه سانتریفوژ شد. سپس مایع رویی را دور ریخته و 2ml محیط Hams به آن اضافه گردید. جهت جداسازي اسپرمهاي حاوي کروموزومXوY با استفاده از گرادیان آلبومین به روش ذیل اعمال گردید:
4ml -1 آلبومین انسانی %10 گرم شده (در دماي آزمایشگاه) به 4 لوله فالکون کوچک به طور مساوي اضافه و به هر کدام مقدار 0/5ml محلول اسپرمی تهیه شده از مرحله قبل افزوده شد و براي مدت 30 دقیقه در دماي 37 C قرار داده شد.
-2 از هر لوله به آرامی حدود 0/5ml رسوب برداشته شد. به خاطر وجود آلبومین %10 و مدت زمان 30 دقیقه و حرارت 37 C درجه اسپرمهاي متحرك ته نشین شدند و نمونه از بخش تهنشین برداشته شد (شکل -1 الف).
-3 از 4 لوله فالکون کوچک استفاده و به هر کدام مقدار 0/5ml آلبومین %20 و سپس 1ml آلبومین %12/5 اضافه گردید. نهایتاً 0/5ml محلول اسپرمی از مرحله قبل به آن افزوده و براي 45 دقیقه در دماي 37C حفظ شد.
-4 اسپرمهاي رسوب کرده (حاوي کروموزوم (Y در هر لوله را با یک پیپت برداشته و با محیط Hams با دور 2000rpm (براي دو مرتبه و هر مرتبه 5 دقیقه) سانتریفوژ شدند. در این حالت اسپرمهاي موجود در محلول بالاي رسوب، حاوي کروموزوم X میباشند (شکل -1 ب).
-5 سپس مایع رویی را دور ریخته و حداکثر 0/5ml محیط Hams به آن اضافه نموده و محلول تا انجام IUI در انکوباتور نگهداري شد.
انجام :IUI حدوداً 35 ساعت بعد از تزریق hCG، عمل IUI با اسپرم آماده شده انجام شد. حدود 400-500μl
از محلول حاوي بیش از 10 میلیون اسپرم به داخل کاتتر ترانسفر کشیده و به طور کامل به داخل حفره رحمی تخلیه شد. حدود 20 دقیقه، فرد تحت عمل IUI به صورت خوابیده باقی ماند و سپس ترخیص شد.
بارداري: اولین آزمایش بارداري حدود 2 هفته بعد از عمل IUI انجام شد تا براساس میزان hCG وضعیت بارداري شیمیایی مشخص شود. یک ماه بعد، با انجام سونوگرافی و مشاهده تپش قلب، بارداري کلینیکی به ثبت رسید. موارد سقط یا زایمان نیز ثبت شد.
روش آماري: تمام دادهها با استفاده از نرم افزار SPSS و آزمون χ2، t و ناپارامتري ویلکاکسون مورد آنالیز آماري قرار گرفت و p<0.05 به عنوان سطح معنیداري آماري در نظر گرفته شد.
نتایج
در این بررسی حداقل و حداکثر سن زنان به ترتیب 21 و 43 سال با میانگین 32/97 ± 5/4 سال بود و مردان داراي سن 28 تا 45 سال با میانگین 37/84±4/3 سال بودند. 30 زوج حداقل یک فرزند سالم داشتند و از این تعداد فقط 2 زوج، هر یک داراي یک فرزند پسر بودند.
به طور متوسط تعداد فرزندان هر زوج قبل از درمان 1/50±0/84 فرزند بود. نتایج حاصله از وضعیت زوجهاي تحت درمان IUI به منظور دستیابی به جنس فرزند دلخواه در جدول 1 ارائه شده است. دو زوج نابارور با سن 24 و 25 سال متقاضی جنس پسر بودند که نتیجه بارداري در یک زوج منفی بود و جنین
