بخشی از مقاله
چکیده:
بافت ریشه اندام بسیار مستعدي در زمیته سنتز یا تجمع متابولیت هاي ثانویه مهم از جمله آلکالوئید ها ، پلی استیلن،سسکوئی ترپن ها و نفتوکوئینون ها است. تمامی این ترکیبات در بافت هاي ریشه هاي موئین نیز قابل سنتزاند. در دو دهه ي اخیر توجه قابل ملاحظه اي به سنتز چنین ترکیباتی در ریشه هاي تغییر یافته ژنتیکی شده است زیرا ریشه هاي موئین برخلاف سوسپانسیون سلولی،متابولیت هاي ثانویه را با ثبات بیشتري تولید می کنند همچنین میزان سنتز این ترکیبات قابل مقایسه با ریشه هاي غیرتراریخت و حتی بیشتر از آنهاست .
کاسنی - . - Cichorium intybus L گیاهی دارویی، دو ساله یا پایا و متعلق به تیره گل ستاره اي ها - Asteraceae - است. این گیاه حاوي ترکیبات دارویی بسیار مهمی از جمله اینولین، اسکولین، ترکیبات فرار - مونوترپن ها و سسکوئی ترپن ها - ،کومارین، فلاونوئید ها و ویتامین هاست.در طب از ریشه ي این گیاه در درمان بیماري هاي کبدي و محل زخم و همچنین به عنوان اشتها آور، هاضم، مسهل صفرا، تصفیه کننده، مدر، تنظیم کننده قاعدگی و تب بر استفاده می شود.
در این تحقیق به منظور بهینه سازي سنتز ریشه موئین، کوتیلدون هاي گیاه کاسنی با چهار سویه از اگروباکتریوم ریزوژنز A4، A13، 11325و15834 تلقیح و بر روي سه تیمار محیط کشت شامل MS، LS و B5 کشت شدند.تعداد ریشه هاي تولید شده در تیمارهاي محیط کشت و میزان تراریختی، با انجام واکنش PCR براي تایید وجود ژن rol B، به عنوان مقیاسی براي بیماري زایی در نظر گرفته شدند. سویه هاي A4،A13 و15834 موفق به تولید ریشه موئین شدند. سویه A13 با فراوانی تولید %48/94 - - ریشه هاي مویین و میزان تراریختی - - %68 به عنوان مستعد ترین سویه گزارش شد. بر اساس نتایج بدست آمده، محیط کشت MS ،مناسب ترین محیط کشت بمنظور ایجاد ریشه موئین و کشت هاي پسین معرفی شد.
مقدمه:
بهبود فعالیت و جهت دهی مسیر بیوسنتز متابولیت ها در سلول هاي گیاهی، از اهداف اصلی دانش مهندسی متابولیک محسوب می شود. تکمیل، ترسیم و تفسیر جامع نقشه هاي متابولیکی، امکان دستورزي و مطالعه بهتر مسیر هاي بیوسنتزي در گیاهان را براي محققین فراهم می کند. تکنولوژي DNA نوترکیب و انتقال ژن بواسطه آگروباکتریوم عمده ترین تکنیک هایی هستند که در مهندسی متابولیک براي ایجاد گیاهان هدف واجد صفات مورد نظر استفاده می شوند.
استفاده از آگروباکتریوم رایزوژنز و کشت ریشه هاي موئین بعلت رشد سریع، زمان دو برابر شدن کوتاه، سهولت نگهداري و توانایی سنتز گستره اي از ترکیبات شیمیایی، مزیت هاي بیشتري را بعنوان یک منبع پیوسته براي تولید متابولیت هاي ثانویه ارزشمند ایجاد می نماید
علاوه بر این، ریشه هاي موئین یک سیستم مدل ارزشمند براي ارزیابی، توسعه و کاربرد اصول مهندسی ژنتیک در گیاهان هستند. ریشه هاي تراریخته از قابلیت باززایی گیاهان کامل برخوردارند، همچنین گیاهان باززایی شده از ریشه هاي موئین مانند خود آنها، ثبات ژنتیکی دارند. براي استفاده از آگروباکتریوم رایزوژنز در تراریختی گیاهی، موارد آزمایشی مختلفی باید بهینه سازي شوند. این موارد عبارتند از بهینه سازي شرایط محیط کشت، پیدا نمودن یک نژاد آگروباکتریوم که ژنوتیپ گیاهی مورد نظر را به نحو مطلوب آلوده نماید، طراحی و ساخت T- DNA تغییر یافته اي که امکان بیان ژن در سلول هاي گیاهی را فراهم نماید، انتقال T- DNA تغییریافته به نژاد آگروباکتریوم انتخاب شده، انتقال T- DNA توسط آگروباکتریوم به گیاه با فراوانی زیاد و در نهایت گزینش سلول هاي گیاهی تراریخته و باززایی گیاه از آنها.
در همین راستا در تحقیق حاضر تاثیر سویه هاي مختلف باکتري آگروباکتریوم براي القاء ریشه هاي تراریخت در گیاه دارویی کاسنی - . - Chicorium intybus L، بررسی گردید. کاسنی حاوي متابولیت هاي ثانویه شناخته شده ي فراوان و مهمی از جمله اینولین، اسکولین و کومارین است که درصد بالایی از ماده ي خشک این گیاه را تشکیل می دهد - 2و. - 3 بهینه سازي شرایط تراریختی در این گیاه از دو منظر حائز اهمیت خواهد بود. اول این که، امکان بررسی قابلیت هاي بیوسنتزي ریشه هاي موئین را در این گیاه فراهم می کند، و ثانیا با ارزیابی میزان پاسخ دهی کاسنی به آلودگی با آگروباکتریوم رایزوژنز و بهینه سازي شرایط باززایی، می توان از آن بعنوان یک مدل بالقوه براي انتقال ژن و مهندسی ژنتیک سود جست.
مواد و روش تهیه ریزنمونه:
به منظور تهیه گیاهچه استریل، بذور کاسنی پس از ضدعفونی در محیط MS حاوي %3 ساکارز و %0.8 آگار کشت گردید و سپس در دماي 25±2درجه سانتی گراد و شرایط نوري 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگهداري شد. کوتیلدون هاي استریل 5 تا 7 روزه به منظور تلقیح با باکتري مورد استفاده قرار گرفتند.
تهیه باکتري:
در این تحقیق به منظور ایجاد ریشه هاي موئین از 4 سویه باکتري A.rhizogenes با اسامی A4, 15834, A13, 11325استفاده شد. براي اثبات ریشه زا بودن باکتري ها، استخراج DNA به روش کوربین و همکاران انجام شد و سپس واکنش زنجیره اي پلیمراز براي تکثیر قطعه اي از ژن هاي rol B و rol C انجام شد.
تلقیح ریز نمونه ها با باکتري:
بمنظور تهیه ي سوسپانسیون تلقیح، سویه هاي باکتري در محیط LB مایع حاوي 50 mg/l ازآنتی بیوتیک ریفامسین - به استثناي سویه - A13 و 100µM استوسرینگون، در دماي 25±2 ˚c بصورت شبانه رشد داده شدند.در ادامه باکتري در دماي 4˚ c و4500 rpm رسوب داده شد و پلت باکتري در محیط MS نیم غلظت حاوي 100µM استوسرینگون به آرامی حل شد.
سپس ریزنمونه هاي کوتیلدونی در سوسپانسیون تلقیح به مدت 2 دقیقه غوطه ور شدند، و پس از خشک شدن روي کاغذ صافی استربل روي سه نوع محیط کشت - 4 - MS ، - 5 - LS و - 6 - B5کشت گردیدند. پلیت هاي حاوي ریزنمونه هاي گیاهی در تاریکی، به مدت 48 ساعت و در دماي 25±2 ˚c انکوبه شدند.چهل وهشت ساعت پس از انجام تلقیح، بمنظور حذف باکتري، ریزنمونه ها به محیط کشت جامد MSحاوي 500 mg/l آنتیبیوتیک سفوتاکسیم منتقل شد. عمل انتقال، چند مرتبه تا حذف کامل باکتري از اطراف ریزنمونهها تکرار شد.
بررسی اثر نوع محیط کشت و سویه باکتري :
بمنظور انتخاب محیط کشت بهینه و سویه برتر در رشد ریشه ها، ریشه هاي حاصل از یک کلون از هر سویه باکتري به طور جداگانه در سه نوع محیط MS ،LS و B5 در سه تکرار کشت شدند. پس از گذشت 28 روز وزن خشک ریشه ها یادداشت برداري شد.
تعیین فنوتیپ رشد ریشه هاي موئین:
از آنجا که هر ریشه موئین از یک سلول تراریخته منشاء میگیرد، بنابراین میتوان هر ریشه موئین را یک کلون در نظر گرفت. بر این اساس براي بررسی فنوتیپ رشدي کشتهاي کلون ریشه موئین، ده کلون از هر سویه باکتري انتخاب شد. سپس نوك ریشههاي فعال در حال رشد در هر کلون قطع شد و هر نوك ریشه بطور جداگانه به ارلن هاي 250 میلی لیتري حاوي 50 ccمحیط کشت MS مایع در سه تکرار انتقال یافت. ظروف در تاریکی و دماي 25˚c بر روي شیکر چرخشی با سرعت 90 rpm بمدت یک ماه نگهداري شد. سپس وزن خشک ریشه ها اندازه گیري شد.
نتایج تائید ریشه زا بودن باکتري ها:
واکنش زنجیره اي پلیمراز با پرایمر هاي اختصاصی ژن rol B و مختلف باکتري، منجر به تکثیر نواري به طول تقریبی 430 bp تقریبی612 bp با آغازگرهاي اختصاصی ژن rol C گردید.
شکل ١- نتایج آنالیز PCR ژن rol B آگروباکتریوم رایزوژنز.سایزمارکر - ١ - ، باند تکثیر شده از DNA باکتری سویه ھای - 11325٢ - ، - A4٣ - ، - A13۴ - ، - 15834۵ - .
مقایسه کارآیی سویه هاي مختلف A.rhizogenes در تراریزش نمونه ها:
اولین ریشه ها پس از گذشت 8 روز از زمان تلقیح باکتري ظاهر شدند شکل - . - 2 نمودار - 1 - درصد ریزنمونه هایی را که به تلقیح سویه هاي مختلف باکتري پاسخ مثبت داده اند، در سه نوع محیط کشت مختلف MS، LS و B5، نشان می دهد. همانطور که مشاهده می شود سویه ي A13 در محیط کشت %63/15 - MS - ، بالاترین کارایی در انتقال T-DNA به ریزنمونه هاي کوتیلدونی را نشان داده است.
از میان چهار سویه بکار برده شده، سویه 11325 تنها منجر به ظهور کالوس و توده ي تومور مانندي در محل زخم شد و درصد ریشه زایی براي آن صفر در نظر گرفته شد. همچنین در مجموع به ترتیب %36/47 و %18/2 ریزنمونه ها، در اثر تلقیح با سویه هاي A4 و15834 تولید ریشه موئین نمودند. علاوه بر این محیط کشت MS با %45/34 ریشه زایی، بهترین ترکیب محیطی براي ظهور ریشه هاي موئین در مجموع سویه ها بوده است.
نمودار١- درصد ریشه ھای موئین سنتز شده درمقایسه بین سه تیمار محیطی و سه سویه مختلف A.rhizogenes
مقایسه اثر سویه و نوع محیط کشت MS، LS و B5 بر وزن خشک ریشه هاي موئین:
بر این اساس بیشترین میزان وزن خشک ریشه موئین، در محیط MS و تراریختی با سویه A13 و کمترین وزن خشک ریشه موئین در محیط B5 و در اثر تراریختی با سویه A4 مشاهده شد
