دانلود مقاله همسانه سازی و ارزیابی فعالیت پیشبر القایی Rd29A در گیاهان تراریخت توتون

word قابل ویرایش
11 صفحه
9700 تومان
97,000 ریال – خرید و دانلود

مقدمه

خشکی، شوری و دمای پایین سه عامل محیطی مهمی از جمله مهم ترین پیشبرهایی که برای تولید گیاهان
هستند که رشد و نمو و تولید گیاه را محدود مینماید. به تراریخته متحمل به تنشهای غیرزیستی استفاده شده است
طور کلی تنشهای غیرزیستی مجموعهای از پاسخهای میتوان به پیشبر CaMV35S، یوبیکوتین۱، و اکتین اشاره
بیوشیمیایی، فیزیولوژیکی و نموی را در گیاه القاء مینمایند نمود. این پیشبرها همیشه فعال بوده و در تمامی بافتها و
که باعث کاهش خسارت به گیاه میشوند ۱)، ۲، .(۱۰ شرایط با قدرت بالایی باعث بیان ژن میشوند. به عنوان
با پیشرفت زیستفناوری و به ویژه مهندسی ژنتیک، امکان مثال، در مواردی که ضروری است میزان بیان تراژن بالا
باشد (مانند (LEA3A استفاده از یک پیشبر قوی مانند
افزایش مقاومت گیاهان به تنشهای غیرزیستی چشم اندازی
CaMV35S اجتناب ناپذیر خواهد بود.
امید بخش به همراه داشته است. یکی از جنبههای مهم

فناوری تراریختی گیاهان بیان کنترل شده تراژنها میباشد. با این وجود، تولید دائمی مولکولهایی مانند ترهالوز (۱۷)
پیشبرها بخشی از توالی DNA در بالادست ژنها هستند که یا پلی آمینها (۴) باعث رشد غیرطبیعی گیاه در شرایط
نقش مستقیمی در کارآیی و چگونگی بیان آنها دارند. طبیعی میشود. همچنین، تولید این دسته از ترکیبات
پیشبرها را میتوان به طور کلی در سه دسته دائمی، القایی می تواند از نظر متابولیکی برای گیاه هزینهبر و گران باشد.
و اختصاصی بافت قرار داد. در چنین شرایطی، استفاده از یک پیشبر القاء شونده با تنش

۴۸۰

Agrobacterium tumefaciens
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)

بسیار مطلوب خواهد بود. مطالعات انجام شده در گیاهان نشان داده است که ژنهای متعددی با این تنشها ارتباط دارند. برخی از این ژنها تحت شرایط تنشی القاء می شوند.
بنابراین استفاده از پیشبر این ژنها میتواند در تنظیم بیان ژن در گیاهان تراریخته مورد استفاده قرار گیرد. آنچه مسلم است، یک پیشبر القایی ایدهآل نه تنها باید در غیاب عامل القایی هیچ گونه بیان ژنی را سبب نشود بلکه این بیان باید برگشتپذیر و وابسته به دز هم باشد.

به منظور شناسایی عناصر فعال سیس و ترانس دخیل در بیان ژن، ناحیه تنظیم رونویسی ژنهای القاء شونده توسط سرما و خشکی مورد بررسی قرار گرفته است .(۱۹) بیشتر پیشبرهای القاء شونده توسط تنش دارای یک عنصر فعال سیس اختصاصی تنش هستند که توسط یک عامل رونویسی مناسب شناسایی میشود. برای مثال، rd29A و rd29B از جمله ژنهای حساس به تنش هستند اما تحت شرایط تنشی به صورت محتلفی القاء میشوند. پیشبر

Rd29A شامل دو عنصر DRE و ABRE است. خشکی، شوری بالا و دمای پایین باعث القای این پیشبر میشود

.(۲۱) در حالی که پیشبر Rd29B تنها دارای عنصر ABRE

بوده و القای آن وابسته به هورمون ABA میباشد. فرابیان عامل رونویسی DREB1A تحت کنترل پیشبر القایی

Rd29A نسبت به پیشبر CaMV35S باعث شد که گیاه رشد و فنوتیپ ظاهری بهتری داشته باشد .(۱۰)

پیشبر القایی Rd29A نه تنها در Arabidopsis thaliana،

توتون و گندم مورد مطالعه قرار گرفته است ۷)، (۲۰ بلکه به صورت متصل به ژن گزارشگر gus به سیب زمینی هم منتقل شده است .(۲۴) در این پژوهش، فعالیت القایی پیشبر Rd29A پس از همسانهسازی از گیاه آرابیدوپسیس در گیاه توتون مورد بررسی قرار گرفته است.

مواد و روشها

جلد ۲۶، شماره ۴، ۱۳۹۲

ساخت ناقل پلاسمید : pBI-RD-GUS توالی DNA

پیشبر Rd29A از بانک ژن ( http://

( www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi و با شماره

دسترسی Ay577523 مربوط به گیاه آرابیدوپسیس به دست

آمد. براساس این توالی آغازگرهای اختصاصی این پیشبر

F -Rd: 5″-AAG CTT GCC ATA GAG CAT TTC )

AA-3″ و R-Rd: 5″-TCC AGA TTC CAA AGA TTT

(TTC T-3″ برای تکثیر قطعه ای به طول ۹۱۰ جفت باز طراحی و ساخته شد. برای استخراج DNA ژنومی به روش دلاپورتا (۶) از برگهای گیاه آرابیدوپسیس استفاده شد. از DNA استخراج شده به عنوان الگو جهت جداسازی پیشبر Rd29A به وسیله واکنش زنجیری پلیمراز

(PCR) و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی استفاده شد.

برای انجام PCR از دمای ۹۴ درجه سانتی گراد برای واسرشتسازی اولیه به مدت ۴ دقیقه استفاده گردید. در ادامه ۳۵ چرخه با شرایط زیر انتخاب شد: واسرشتسازی یک دقیقه در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد؛ اتصال یک دقیقه در دمای ۳۵ درجه سانتی گراد و بسط دو دقیقه در دمای

۷۲ درجه سانتی گراد؛ در پایان ۴ دقیقه اضافه برای بسط نهایی در ۷۲ درجه سانتی گراد در نظر گرفته شد.

پس از تکثیر، همسانهسازی پیشبر Rd29Aً در ناقل T/A

(ناقل InsTAclone TM PCR Cloning Kit# ) (pTZ57R/T

(K1214, Fermentas صورت گرفت. به منظور همسانه سازی پیشبر Rd29A در پلاسمید pBI121، ابتدا با استفاده از آنزیمهای برشی XbaI و HindIII پیشبر Rd29A از ناقل کلونینگ جدا شده و جایگزین پیشبر CaMV35S در بالادست ژن gus پلاسمید pBI121 قرار گفت .(۱۸) جهت تأیید الحاق پیشبر در پلاسمیدpBI121 آزمون PCR با آغازگرهای اختصاصی Rd29A و هضم آنزیمی توسط آنزیمهای برشی XbaI و HindIII انجام شد. پس از تأیید نهایی سازه نوترکیب حاصل که pBI-RD-GUS نامگذاری شد (شکل (۱، انتقال این پلاسمید به باکتری

انجام گرفت. سلولهای

۴۸۱

CaMV35S GUS

Rd29A-GUS و-
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۴، ۱۳۹۲

مستعد سویه AGLO1 باکتری A. tumefaciens به روش ذوب و انجماد تراریخت گردیدند (۱۸) و در محیط کشت جامد حاوی کانامایسین (۵۰ mg/l) و ریفامپسین ( ۷۵ (mg/l در دمای ۲۸ درجه سانتی گراد به مدت ۲ تا ۳ روز کلنیها ظاهر شدند. تأیید تراریختی اگروباکتریوم با استفاده از آزمونهای PCR با آغازگرهای اختصاصی Rd29A انجام گردید. از اگروباکتریوم حاوی پلاسمید pBI121 به عنوان کنترل در تراریختی استفاده شد.

تراریختی گیاه توتون : جهت ارزیابی کارآیی پیشبر

Rd29A کاست ژنی pBI-RD-GUS برای تراریختی گیاه توتون (رقم (Xanti مورد استفاده قرار گرفت. به منظور مقایسه پیشبر القایی Rd29A با پیشبر دائمی CaMV35S از ناقل دوگانه pBI121 به عنوان کنترل استفاده شد. تراریختی گیاه توتون با روش Horch و همکاران (۸) انجام شد.

بدین منظور قطعات جداکشت برگی گیاه توتون با کشت سوسپانسیون سلولی شبانه سویه های اگروباکتریومی حاوی پلاسمیدهای pBI-RD-GUS و pBI121 آلوده شد. قطعات جداکشت برگی آلوده شده به محیط MS جامد (۱۴)

حاوی ۲ میلی گرم/لیتر BAP، ۰/۱ میلی گرم در لیتر

NAA، ۳۰ گرم/لیتر ساکارز کشت شد. بعد از ۴۸ ساعت هم کشتی نمونه ها به محیط کشت MS حاوی هورمونهای فوق و عامل گزینش گر کانامایسین ۱۰۰ میلی گرم/ لیتر و آنتی بیوتیک سفوتاکسیم ۲۵۰ میلی گرم/ لیتر (برای حذف آلودگی اگروباکتریومی) منتقل شدند. نمونهها در شرایط نوری ۴۰۰۰ لوکس، دمای ۲۵ درجه سانتی گراد و دوره نوری ۱۶ ساعت به مدت ۳ هفته قرار گرفتند. پس از ظهور اندامهای هوایی، ساقههایی که به اندازه کافی رشد کرده بودند به محیط ریشهزایی شامل محیط ۱/۲ MS به همراه ۲

میلیگرم در لیتر اندول بوتیریک اسید (IBA) و آنتی-

بیوتیکهای کانامایسین و سفوتاکسیم منتقل شدند.

نمونههای ریشهدار شده در محیط حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین به گلدان (با ترکیب خاکی ماسه، پرلیت، پیت و

ورمیکولیت به نسبتهای ۴۰ درصد، ۴۰ درصد، ۵ درصد و

۱۵ درصد) منتقل شدند.

آنالیز مولکولی گیاهان تراریخته: آنالیز :PCR برای اثبات حضور ژنهای منتقل شده به گیاه توتون پس از استخراج
DNA از گیاهان (۱۸) از روش PCR به کمک آغازگرهای اختصاصی پیشبر Rd29A (قبلا ذکر شد)، ژنهای F-) gus gus: 5″-GGT GGG AAA GCG AGA CGA-3″ و-R (gus: 5″- ACC TAA GGC CGT ATC AAT-3″ و nptII

F-nptII:5″-GAA CAA GAT GGA TTG CAC GC-3″)

و R-nptII:5″- GAA GAA CTC GTC AAG AAG GC-(3″ استفاده شد. انجام PCR در همه نمونهها در شرایط دمای ۹۴ درجه سانتی گراد برای واسرشتسازی اولیه به مدت ۴ دقیقه، و ۳۵ چرخه شامل مرحله واسرشتسازی یک دقیقه در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد، مرحله اتصال یک دقیقه در دمای ۶۰ درجه سانتی گراد و مرحله بسط یک دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد و در پایان ۴

دقیقه اضافه برای بسط نهایی در ۷۲ درجه سانتی گراد در نظر گرفته شد. در نهایت نمونههای تکثیر شده بر روی ژل آگارز الکتروفورز شده و آنالیز باندها پس از عکسبرداری انجام شد.

روش ارزیابی بیان ژن gus در گیاهان توتون تحت

شرایط تنش: به منظور بررسی بیان ژن gus با استفاده از پیشبر القایی Rd29A و همچنین پیشبر دائمی CaMV35S و
نقش این پیشبرها در شرایط مختلف تنشی، گیاهان

تراریخته توتون حاوی سازههای ژنی

تحت تیمارهای تنشی مختلف قرار

گرفتند. پس از انجام تیمارهای مختلف نمونههای برگی به منظور ارزیابی هیستوشیمیایی ژن gus در تیوبهای حاوی محلول رنگآمیزی X-Gluc برای ۳۶-۳۸ ساعت در دمای

۳۷ درجه سانتی گراد قرار داده گرفته و سپس در الکل ۷۰

درصد شسته شدند .(۹)

۴۸۲

مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۴، ۱۳۹۲

EcoRI XbaI HindIII
P- nos

T-nos Gus Rd29A T- nos nptII

LB RB

شکل -۱ سازه نوترکیب pBI-RD-GUS مورد استفاده در تراریختی گیاه توتون

تنش شوری : NaCl غلظتهای مختلف از NaCl (صفر،

۱۰۰، ۲۰۰و mM (300 در محیط پایه MS تهیه گردید و قسمتی از بافت برگی گیاه تراریخته و شاهد به مدت ۶

ساعت در این محلول جهت اعمال تیمار شوری در دمای اتاق غوطهور گردید. با آزمون هیستوشیمیایی GUS بیان ژن gus مورد بررسی قرار گرفت.

تیمار تنش خشکی :(PEG) تیمارهای ۱۰) PEG، ۲۰ و ۳۰ درصد) در محیط پایه MS تهیه گردید و قسمتی از بافت برگی گیاهان تراریخته و شاهد به مدت ۶ ساعت در این محلول جهت اعمال تیمار خشکی در دمای اتاق غوطهور گردید. از آزمون هیستوشیمیایی GUS برای بررسی القاء پذیری پیشبرها استفاده شد.

تنش : ABA محلول پایهای از محیط MS که حاوی ۱۰۰

میکرومول ABA( ʽM) بود تهیه گردید سپس قطعات تازه برگی از گیاهان تراریخته با ژن Rd29A-GUS و CaMV35S-GUS در این محلول به مدت ۶ ساعت غوطهور گردیده و سپس جهت بررسی القاء پذیری پیشبر آزمون هیستوشیمیایی GUS انجام شد.

نتایج

ساخت حامل پلاسمیدی : pBI-RD-GUS پیشبر Rd29A

از ژنوم گیاه آرابیدوپسیس با استفاده از روش PCR

جداسازی گردیده و در نهایت جایگزین پیشبر CaMV35S

در ناقل دوگانه pBI121 وارد شد (شکل .(۱ با استفاده از آنالیزهای مختلف از جمله هضم آنزیمی با آنزیمهای

XbaI – HindIII (جهت جداسازی پیشبر (Rd29A و

XbaI-EcoRI (جهت جداسازی ژن (gus، حضور پیشبر و ژن gus در سازه جدید نوترکیب pBI-RD-GUS تأیید شد
(شکل ۱ و .(۲

این فقط قسمتی از متن مقاله است . جهت دریافت کل متن مقاله ، لطفا آن را خریداری نمایید
word قابل ویرایش - قیمت 9700 تومان در 11 صفحه
97,000 ریال – خرید و دانلود
سایر مقالات موجود در این موضوع
دیدگاه خود را مطرح فرمایید . وظیفه ماست که به سوالات شما پاسخ دهیم

پاسخ دیدگاه شما ایمیل خواهد شد