بخشی از مقاله
مقدمه
خشکی، شوري و دماي پایین سه عامل محیطی مهمی از جمله مهم ترین پیشبرهایی که براي تولید گیاهان
هستند که رشد و نمو و تولید گیاه را محدود مینماید. به تراریخته متحمل به تنشهاي غیرزیستی استفاده شده است
طور کلی تنشهاي غیرزیستی مجموعهاي از پاسخهاي میتوان به پیشبر CaMV35S، یوبیکوتین1، و اکتین اشاره
بیوشیمیایی، فیزیولوژیکی و نموي را در گیاه القاء مینمایند نمود. این پیشبرها همیشه فعال بوده و در تمامی بافتها و
که باعث کاهش خسارت به گیاه میشوند 1)، 2، .(10 شرایط با قدرت بالایی باعث بیان ژن میشوند. به عنوان
با پیشرفت زیستفناوري و به ویژه مهندسی ژنتیک، امکان مثال، در مواردي که ضروري است میزان بیان تراژن بالا
باشد (مانند (LEA3A استفاده از یک پیشبر قوي مانند
افزایش مقاومت گیاهان به تنشهاي غیرزیستی چشم اندازي
CaMV35S اجتناب ناپذیر خواهد بود.
امید بخش به همراه داشته است. یکی از جنبههاي مهم
فناوري تراریختی گیاهان بیان کنترل شده تراژنها میباشد. با این وجود، تولید دائمی مولکولهایی مانند ترهالوز (17)
پیشبرها بخشی از توالی DNA در بالادست ژنها هستند که یا پلی آمینها (4) باعث رشد غیرطبیعی گیاه در شرایط
نقش مستقیمی در کارآیی و چگونگی بیان آنها دارند. طبیعی میشود. همچنین، تولید این دسته از ترکیبات
پیشبرها را میتوان به طور کلی در سه دسته دائمی، القایی می تواند از نظر متابولیکی براي گیاه هزینهبر و گران باشد.
و اختصاصی بافت قرار داد. در چنین شرایطی، استفاده از یک پیشبر القاء شونده با تنش
480
Agrobacterium tumefaciens
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)
بسیار مطلوب خواهد بود. مطالعات انجام شده در گیاهان نشان داده است که ژنهاي متعددي با این تنشها ارتباط دارند. برخی از این ژنها تحت شرایط تنشی القاء می شوند.
بنابراین استفاده از پیشبر این ژنها میتواند در تنظیم بیان ژن در گیاهان تراریخته مورد استفاده قرار گیرد. آنچه مسلم است، یک پیشبر القایی ایدهآل نه تنها باید در غیاب عامل القایی هیچ گونه بیان ژنی را سبب نشود بلکه این بیان باید برگشتپذیر و وابسته به دز هم باشد.
به منظور شناسایی عناصر فعال سیس و ترانس دخیل در بیان ژن، ناحیه تنظیم رونویسی ژنهاي القاء شونده توسط سرما و خشکی مورد بررسی قرار گرفته است .(19) بیشتر پیشبرهاي القاء شونده توسط تنش داراي یک عنصر فعال سیس اختصاصی تنش هستند که توسط یک عامل رونویسی مناسب شناسایی میشود. براي مثال، rd29A و rd29B از جمله ژنهاي حساس به تنش هستند اما تحت شرایط تنشی به صورت محتلفی القاء میشوند. پیشبر
Rd29A شامل دو عنصر DRE و ABRE است. خشکی، شوري بالا و دماي پایین باعث القاي این پیشبر میشود
.(21) در حالی که پیشبر Rd29B تنها داراي عنصر ABRE
بوده و القاي آن وابسته به هورمون ABA میباشد. فرابیان عامل رونویسی DREB1A تحت کنترل پیشبر القایی
Rd29A نسبت به پیشبر CaMV35S باعث شد که گیاه رشد و فنوتیپ ظاهري بهتري داشته باشد .(10)
پیشبر القایی Rd29A نه تنها در Arabidopsis thaliana،
توتون و گندم مورد مطالعه قرار گرفته است 7)، (20 بلکه به صورت متصل به ژن گزارشگر gus به سیب زمینی هم منتقل شده است .(24) در این پژوهش، فعالیت القایی پیشبر Rd29A پس از همسانهسازي از گیاه آرابیدوپسیس در گیاه توتون مورد بررسی قرار گرفته است.
مواد و روشها
جلد 26، شماره 4، 1392
ساخت ناقل پلاسمید : pBI-RD-GUS توالی DNA
پیشبر Rd29A از بانک ژن ( http://
( www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi و با شماره
دسترسی Ay577523 مربوط به گیاه آرابیدوپسیس به دست
آمد. براساس این توالی آغازگرهاي اختصاصی این پیشبر
F -Rd: 5"-AAG CTT GCC ATA GAG CAT TTC )
AA-3" و R-Rd: 5"-TCC AGA TTC CAA AGA TTT
(TTC T-3" براي تکثیر قطعه اي به طول 910 جفت باز طراحی و ساخته شد. براي استخراج DNA ژنومی به روش دلاپورتا (6) از برگهاي گیاه آرابیدوپسیس استفاده شد. از DNA استخراج شده به عنوان الگو جهت جداسازي پیشبر Rd29A به وسیله واکنش زنجیري پلیمراز
(PCR) و با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی استفاده شد.
براي انجام PCR از دماي 94 درجه سانتی گراد براي واسرشتسازي اولیه به مدت 4 دقیقه استفاده گردید. در ادامه 35 چرخه با شرایط زیر انتخاب شد: واسرشتسازي یک دقیقه در دماي 94 درجه سانتی گراد؛ اتصال یک دقیقه در دماي 35 درجه سانتی گراد و بسط دو دقیقه در دماي
72 درجه سانتی گراد؛ در پایان 4 دقیقه اضافه براي بسط نهایی در 72 درجه سانتی گراد در نظر گرفته شد.
پس از تکثیر، همسانهسازي پیشبر Rd29Aً در ناقل T/A
(ناقل InsTAclone TM PCR Cloning Kit# ) (pTZ57R/T
(K1214, Fermentas صورت گرفت. به منظور همسانه سازي پیشبر Rd29A در پلاسمید pBI121، ابتدا با استفاده از آنزیمهاي برشی XbaI و HindIII پیشبر Rd29A از ناقل کلونینگ جدا شده و جایگزین پیشبر CaMV35S در بالادست ژن gus پلاسمید pBI121 قرار گفت .(18) جهت تأیید الحاق پیشبر در پلاسمیدpBI121 آزمون PCR با آغازگرهاي اختصاصی Rd29A و هضم آنزیمی توسط آنزیمهاي برشی XbaI و HindIII انجام شد. پس از تأیید نهایی سازه نوترکیب حاصل که pBI-RD-GUS نامگذاري شد (شکل (1، انتقال این پلاسمید به باکتري
انجام گرفت. سلولهاي
481
CaMV35S GUS
Rd29A-GUS و-
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392
مستعد سویه AGLO1 باکتري A. tumefaciens به روش ذوب و انجماد تراریخت گردیدند (18) و در محیط کشت جامد حاوي کانامایسین (50 mg/l) و ریفامپسین ( 75 (mg/l در دماي 28 درجه سانتی گراد به مدت 2 تا 3 روز کلنیها ظاهر شدند. تأیید تراریختی اگروباکتریوم با استفاده از آزمونهاي PCR با آغازگرهاي اختصاصی Rd29A انجام گردید. از اگروباکتریوم حاوي پلاسمید pBI121 به عنوان کنترل در تراریختی استفاده شد.
تراریختی گیاه توتون : جهت ارزیابی کارآیی پیشبر
Rd29A کاست ژنی pBI-RD-GUS براي تراریختی گیاه توتون (رقم (Xanti مورد استفاده قرار گرفت. به منظور مقایسه پیشبر القایی Rd29A با پیشبر دائمی CaMV35S از ناقل دوگانه pBI121 به عنوان کنترل استفاده شد. تراریختی گیاه توتون با روش Horch و همکاران (8) انجام شد.
بدین منظور قطعات جداکشت برگی گیاه توتون با کشت سوسپانسیون سلولی شبانه سویه هاي اگروباکتریومی حاوي پلاسمیدهاي pBI-RD-GUS و pBI121 آلوده شد. قطعات جداکشت برگی آلوده شده به محیط MS جامد (14)
حاوي 2 میلی گرم/لیتر BAP، 0/1 میلی گرم در لیتر
NAA، 30 گرم/لیتر ساکارز کشت شد. بعد از 48 ساعت هم کشتی نمونه ها به محیط کشت MS حاوي هورمونهاي فوق و عامل گزینش گر کانامایسین 100 میلی گرم/ لیتر و آنتی بیوتیک سفوتاکسیم 250 میلی گرم/ لیتر (براي حذف آلودگی اگروباکتریومی) منتقل شدند. نمونهها در شرایط نوري 4000 لوکس، دماي 25 درجه سانتی گراد و دوره نوري 16 ساعت به مدت 3 هفته قرار گرفتند. پس از ظهور اندامهاي هوایی، ساقههایی که به اندازه کافی رشد کرده بودند به محیط ریشهزایی شامل محیط 1/2 MS به همراه 2
میلیگرم در لیتر اندول بوتیریک اسید (IBA) و آنتی-
بیوتیکهاي کانامایسین و سفوتاکسیم منتقل شدند.
نمونههاي ریشهدار شده در محیط حاوي آنتی بیوتیک کانامایسین به گلدان (با ترکیب خاکی ماسه، پرلیت، پیت و
ورمیکولیت به نسبتهاي 40 درصد، 40 درصد، 5 درصد و
15 درصد) منتقل شدند.
آنالیز مولکولی گیاهان تراریخته: آنالیز :PCR براي اثبات حضور ژنهاي منتقل شده به گیاه توتون پس از استخراج
DNA از گیاهان (18) از روش PCR به کمک آغازگرهاي اختصاصی پیشبر Rd29A (قبلا ذکر شد)، ژنهاي F-) gus gus: 5"-GGT GGG AAA GCG AGA CGA-3" و-R (gus: 5"- ACC TAA GGC CGT ATC AAT-3" و nptII
F-nptII:5"-GAA CAA GAT GGA TTG CAC GC-3")
و R-nptII:5"- GAA GAA CTC GTC AAG AAG GC-(3" استفاده شد. انجام PCR در همه نمونهها در شرایط دماي 94 درجه سانتی گراد براي واسرشتسازي اولیه به مدت 4 دقیقه، و 35 چرخه شامل مرحله واسرشتسازي یک دقیقه در دماي 94 درجه سانتی گراد، مرحله اتصال یک دقیقه در دماي 60 درجه سانتی گراد و مرحله بسط یک دقیقه در دماي 72 درجه سانتی گراد و در پایان 4
دقیقه اضافه براي بسط نهایی در 72 درجه سانتی گراد در نظر گرفته شد. در نهایت نمونههاي تکثیر شده بر روي ژل آگارز الکتروفورز شده و آنالیز باندها پس از عکسبرداري انجام شد.
روش ارزیابی بیان ژن gus در گیاهان توتون تحت
شرایط تنش: به منظور بررسی بیان ژن gus با استفاده از پیشبر القایی Rd29A و همچنین پیشبر دائمی CaMV35S و
نقش این پیشبرها در شرایط مختلف تنشی، گیاهان
تراریخته توتون حاوي سازههاي ژنی
تحت تیمارهاي تنشی مختلف قرار
گرفتند. پس از انجام تیمارهاي مختلف نمونههاي برگی به منظور ارزیابی هیستوشیمیایی ژن gus در تیوبهاي حاوي محلول رنگآمیزي X-Gluc براي 36-38 ساعت در دماي
37 درجه سانتی گراد قرار داده گرفته و سپس در الکل 70
درصد شسته شدند .(9)
482
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392
EcoRI XbaI HindIII
P- nos
T-nos Gus Rd29A T- nos nptII
LB RB
شکل -1 سازه نوترکیب pBI-RD-GUS مورد استفاده در تراریختی گیاه توتون
تنش شوري : NaCl غلظتهاي مختلف از NaCl (صفر،
100، 200و mM (300 در محیط پایه MS تهیه گردید و قسمتی از بافت برگی گیاه تراریخته و شاهد به مدت 6
ساعت در این محلول جهت اعمال تیمار شوري در دماي اتاق غوطهور گردید. با آزمون هیستوشیمیایی GUS بیان ژن gus مورد بررسی قرار گرفت.
تیمار تنش خشکی :(PEG) تیمارهاي 10) PEG، 20 و 30 درصد) در محیط پایه MS تهیه گردید و قسمتی از بافت برگی گیاهان تراریخته و شاهد به مدت 6 ساعت در این محلول جهت اعمال تیمار خشکی در دماي اتاق غوطهور گردید. از آزمون هیستوشیمیایی GUS براي بررسی القاء پذیري پیشبرها استفاده شد.
تنش : ABA محلول پایهاي از محیط MS که حاوي 100
میکرومول ABA( ʽM) بود تهیه گردید سپس قطعات تازه برگی از گیاهان تراریخته با ژن Rd29A-GUS و CaMV35S-GUS در این محلول به مدت 6 ساعت غوطهور گردیده و سپس جهت بررسی القاء پذیري پیشبر آزمون هیستوشیمیایی GUS انجام شد.
نتایج
ساخت حامل پلاسمیدي : pBI-RD-GUS پیشبر Rd29A
از ژنوم گیاه آرابیدوپسیس با استفاده از روش PCR
جداسازي گردیده و در نهایت جایگزین پیشبر CaMV35S
در ناقل دوگانه pBI121 وارد شد (شکل .(1 با استفاده از آنالیزهاي مختلف از جمله هضم آنزیمی با آنزیمهاي
XbaI - HindIII (جهت جداسازي پیشبر (Rd29A و
XbaI-EcoRI (جهت جداسازي ژن (gus، حضور پیشبر و ژن gus در سازه جدید نوترکیب pBI-RD-GUS تأیید شد
(شکل 1 و .(2
