بخشی از مقاله
مقدمه
گل کاغذی با نام انگلیسی Bougainvillea و نام علمی Bougainvillea sp. از خانواده Nyctiginaceae می باشد که منشا آن نواحی گرمسیری و نیمه گرمسیری آمریکای جنوبی است - قاسمی قهساره و کافی، . - 1390 گل کاغذی را از طریق بذر، قلمه، خوابانیدن ساقه و کشت بافت می توان تکثیر نمود. ازدیاد بوسیله قلمه بیشتر متداول است . - Gordon, 2002 - این گیاه یکی از گیاهان زینتی مهم در جنوب ایران است و رنگ های متفاوت این گیاه برای زیباسازی فضای سبز شهری لازم است و ریشه زایی قلمه در گل کاغذی سفید به سختی صورت می گیرد بنابراین استفاده از موادی که ریشه زایی قلمه ها را تسهیل کنند لازم است.
اگروباکتریوم رایزوژنز یک باکتری بیماری زای خاکزی است که باعث بیماری موئی شدن ریشه یا ریشه انبوهی در گیاهان دو لپه ای می شود. این باکتری گیاهان دو لپه را آلوده میکند که باعث تولید ریشه های مویین تراریخته میشود این ریشه ها از ثبات بالایی برخوردار بوده و مقدارتولید آنها تا چهار برابر ریشه های معمولی بوده است بیماری زایی این باکتری به حضور یک پلاسمید بزرگ القاء کننده ریشه - Ri - در باکتری بستگی دارد
بیماری موئی شدن ریشه با انتقال قطعه ای از پلاسمید به نام T-DNA به درون سلول گیاهی، ادغام پایدار این قطعه درون ژنوم گیاه و بیان ژن های این قطعه ایجاد می شود . - Gelvin, 2003. & Giri, etal., 2000 - ژن های سرطان زایی با دو مکانیسم متفاوت باعث ایجاد ریشه های موئی در گیاهان می شوند. در یکی از این مکانیسم ها، ژن های سرطان زایی آنزیم های تولید کننده اکسین را کد می کنند و به این ترتیب منجر به ریشه می شوند. در مکانیسم دوم به نظر می رسد باعث افزایش حساسیت سلول های گیاهی نسبت به اکسین می شوند
- Aoky and Syono, 2000 - در پژوهشی به مطالعه واکنش ریشه زایی برخی از گیاهان باغبانی در تلقیح با Agrobacterium rhizogenes پرداختند و به این نتیجه رسیدند که استفاده از اگروباکتریوم رایزوژنز در بعضی از گیاهان، مشکل سخت ریشه زایی را مرتفع نموده است. اگروباکتریوم رایزوژنز باعث افزایش ریشه زایی بطور معنی داری در سطح 5 درصد شده است
در پژوهشی بیان شد که استفاده از اگروباکتریوم رایزوژنز می تواند باعث بهبود ریشه زایی در گیاهان می شود هم در شرایط درون شیشه ای و هم شرایط برون شیشه ای بخصوص در گیاهان چوبی، اما انگیزش ریشه در جنس های علفی محدودتر است
- Caboni and Damino, 1996 در پژوهشی تاثیر تلقیح اگروباکتریوم رایزوژنز روی ریشه زایی درون شیشه ای Vitis vinifera را بررسی کردند. نمونه های انگور در کشت درون شیشه ای با دو استرین از اگروباکتریوم رایزوژنز آلوده شدند. هر دو استرین باعث افزایش معنی داری در تعداد و توسعه ریشه ها، طول و وزن آنها شدند
استفاده از باکتری هایی نظیر آگروباکتریوم رایزوژنز جهت ریشه زائی روشی نو و بدیع می باشد و روش متداول تلقیح قلمه گیاه با آن، آغشته نمودن قلمه با این باکتری می باشد. ویژگی این آزمایش با دیگر آزمایش های مشابه انجام شده این است که در این پژوهش به جای آغشته نمودن قلمه ها با باکتری اگروباکتریوم رایزوژنز از تزریق زیر پوستی آنها استفاده می شود.
مواد و روش ها
در این پژوهش تاثیر باکتری اگروباکتریوم رایزوژنز بر ریشه زایی قلمه های گل کاغذی سفید مورد بررسی قرار گرفت، عملیات اجرایی این پژوهش در اسفند 1391 در شهر بندرعباس انجام گرفت. قلمه های نیمه خشبی به بلندی 20 سانتی متر و با قطر برابر از گل کاغذی سفید را به گونه ای تهیه کردیم که قلمه ها از یک سانتی متری گره پائینی قلمه قطع شدند. برای اینکه بتوانیم باکتری را به قلمه ها تزریق کنیم ابتدا باید یک کلونی از باکتری را در محیط کشت مایع کشت دهیم، به همین منظور 2/5 گرم پودر LB BROTH - ساخت کشور کانادا - را در 125 سی سی آب مقطر حل کردیم و در اتوکلاو به مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی گراد قرار دادیم.
بعد از اتوکلاو و خنک شدن درب فالکون ها را در شرایط استریل و زیر هود باز کردیم و 10 میکرولیتر از محلول آنتی بیوتیک ریفامپیسین - ریفامپین - و یک کلونی از باکتری Agrobacterium. Rhizogenes به محیط های کشت LB اضافه شد و بعد داخل شیکر انکوباتوردار با دمای 28درجه سانتی گراد و160 تا 180 دور در دقیقه به مدت 24 ساعت قرار داده شد . بعد از 24 ساعت که باکتری در محیط کشت مایع رشد کرد بوسیله دستگاه Bio Photometer غلظت باکتری OD600 =0/5 - و - OD600=0/7 را بدست آوردیم.
جهت ضد عفونی قلمه ها، ابتدا نیمه پائین قلمه ها که در ماسه قرار می گیرد را به مدت 45 ثانیه در بنومیل یک در هزار قرار داده و به مدت 10 دقیقه در هوای آزاد قرار داده شد تا خشک شود. سپس به هریک از قلمه ها مقدار 10 واحد - هر واحد سرنگ انسولین 0/1 میلی لیتر است - اگروباکتریوم رایزوژنز توسط سرنگ انسولین از قسمت جدا شده قلمه و از زیر پوست به محل گره ها تزریق شد. پس از 70 روز قلمه ها را از خاک خارج کرده و صفات مربوط به ریشه زایی اندازه گیری کردیم.
صفات مورد بررسی در این آزمایش شامل: مقایسه میزان ریشه دهی در طول زمان، تعداد ریشه ها، طول بلند ترین ریشه، وزن تر ریشه ها ، وزن خشک ریشه ها و درصد قلمه های ریشه دار شده می باشد. لازم به ذکر است که برای تعیین سرعت ریشه دهی در تیمارهای فوق از روز بیستم پس از اعمال تیمارها، هر پنج روز به صورت تصادفی یکی از قلمه ها از هر گلدان بیرون آورده شد و ریشه زایی آن مورد بررسی قرار گرفت. در این پژوهش تعداد 3 تیمار و 3 تکرار داشتیم که برای هر تکرار 15 قلمه در نظر گرفته شد که جمعاً 135 قلمه به کار برده شد. طرح آماری کاربردی طرح کاملا تصادفی می باشد
که مقایسه میانگین ها توسط آزمون چند دامنه ای دانکن صورت گرفت و جهت تجزیه آماری داده ها از نرم افزار رایانه ای MSTATC استفاده شد.
نتایج و بحث
استفاده از اگروباکتریوم رایزوژنز باعث کاهش زمان ظهور اولین ریشه در قلمه های گل کاغذی شده است به صورتی که اولین ریشه در تیمار OD600 =0/5 بیست و پنج روز پس از کاشت مشاهده شد این در حالی بود که ریشه زایی در تیمار شاهد ده روز پس از آن و در روز سی و پنجم مشاهده شد. در تیمار =0/7 اگروباکتریوم رایزوژنز نیز در روز سی ام ریشه زایی مشاهده گردید که نسب به تیمار شاهد ریشه زایی پنج روز کاهش یافته است، همانطور که از نتایج مشاهده می گردد هر دو سطح باکتری زمان ریشه زایی را نسبت به تیمار شاهد کاهش داده اند.
استفاده از باکتری اگروباکتریوم رایزوژنز اثر معنی داری بر درصد ریشه زایی قلمه های گل کاغذی سفید داشته است. بطوریکه با افزایش سطح باکتری ابتدا درصد ریشه زایی افزایش معنی داری یافته و سپس طی یک روند تدریجی کاهش یافته که معنی دار نمی باشد. همانگونه که در این جدول مشاهده می شود، بیشترین درصد ریشه زایی با مقدار 73/3 درصد مربوط به سطح OD600 =0/5 از باکتری بوده است. درصد ریشه زایی با استفاده از باکتری در غلظت هایOD600 =0/5 وOD600 =0/7 به ترتیب با 73/3و 70/8 درصد نسبت به تیمار شاهد با 56/7 درصد افزایش معنی داری داشته است.
جدول -1 مقایسه اثر غلظت های مختلف باکتری بر صفات ریشه زایی
میانگین های موجود در هر ردیف که حداقل دارای یک حرف مشترک هستند، در سطح %5 آزمون دانکن اختلاف معنی داری با هم ندارند.
همانطوریکه در جدول بالا مشاهده می شود، استفاده از باکتری اگروباکتریوم رایزوژنز اثر معنی داری بر طول ریشه داشته است. بطوریکه سطح OD600 =0/5 از باکتری با میانگین 9/9 سانتی متر دارای بیشترین طول ریشه بوده است و نسبت به شاهد با میانگین 8/4 سانتی متر دارای اختلاف معنی داری می باشد، اما با تیمار OD600 =0/7 تفاوت معنی داری ندارد. نتایج نشان دادند که، استفاده از باکتری اگروباکتریوم رایزوژنز اثر معنی داری بر تعداد ریشه در هر قلمه داشته است.
بطوریکه با افزایش سطح باکتری تعداد ریشه در قلمه نیز افزایش معنی داری یافته است و پس از آن نیز در سطح OD600 =0/7 دچار کاهش معنی داری شده است. در این رابطه سطح OD600 =0/5 با میانگین 8 عدد دارای بیشترین تعداد ریشه بوده است و دارای اختلاف معنی داری با سطوح شاهد وOD600 =0/7 می باشد و تیمار شاهد نیز با میانگین 5 عدد دارای کمترین تعداد ریشه بوده است.
همچنین همانطور که مشاهده می شود، استفاده از باکتری اگروباکتریوم رایزوژنز اثر معنی داری بر وزن تر ریشه نداشته است و وزن تر ریشه حتی با استفاده از باکتری در غلظت های متفاوت، نسبت به شاهد تفاوت معنی داری از خود نشان نداده است و تنها در تیمارOD600 =0/5 از باکتری با میانگین 0/523 گرم نسبت به دیگر سطوح، افزایشی را داشته است اما این افزایش معنی دار نمی باشد همچنین استفاده از باکتری اگروباکتریوم رایزوژنز اثر معنی داری بر وزن خشک ریشه نداشته است و وزن خشک تنها در تیمار OD600 =0/7 از باکتری با میانگین 0/252 گرم نسبت به دیگر سطوح، افزایشی را داشته است
