بخشی از مقاله
چکیده
گیاه بنگ دانه - Hyoscyamus muticus - منبع مهمی از آلکالوئیدهای تروپانی از جمله هیوسیاموس و اسکوپولامین می باشد. با توجه به سرعت آهسته تولید متابولیت های ثانویه در طبیعت و مدت زمان طولانی برای تولید آن ها و نیز اقتصادی نبودن میزان تولید این ترکیبات، استفاده از فنون کشت بافت گیاهی برای تولید سریع و انبوه متابولیت های ثانویه و مواد دارویی ضروری به نظر می رسد. در تکنیک کشت ریشه مویین، باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز برای تولید ریشه های مویین مورد استفاده قرار می گیرد، از این ریشه ها می توان بعنوان منبعی برای تولید مواد دارویی استفاده نمود. ریزنمونه های برگ بنگ دانه، با استفاده از باکتری اگروباکتریوم رایزوژنز سویه A4 وLBA9402 آلوده شدند که سویه LBA9402 توانایی تولید بیشترین ریشه مویین را نسبت به سویه دیگر A4 داشت. ریشه های مویین پس از ظهور در محیط کشت جامد B5 تثبیت شدند. نتایج حاصل از PCRبرای ژنrolc از T-DNA باکتری، ماهیت تراریختی ریشه های مویین را تایید نمود.
کلمات کلیدی: اگروباکتریوم رایزوژنز، ریشه مویین، بنگ دانه، تروپان آلکالوئید
مقدمه
در ایران برداشت گونههای مختلف گیاه بنگدانه Hyoscyamus spp. همچنان از محل رویشگاههای طبیعی صورت میگیرد که این امر باعث نابودی بخش قابل توجهی از ژرم پلاسم این گیاه دارویی با ارزش میگردد و کشورمان را از مزایای استفاده از ارقام اصلاح شده با کمیت و کیفیت بالاتر محروم میسازد.[1] جنس بنگ دانه حاوی ترکیبات تروپان آلکالوئیدی میباشدو متعلق به خانواده سیب زمینیسانان 1است. برای این جنس سه زیر جنس با نامهایDendrotrichon، Hyoscyamus ,Parahyoscyamus معرفی شده است.[2] تروپان آلکالوئیدها به طور گسترده ای با اهداف دارویی مورد استفاده قرار میگیرند. این ترکیبات توسط جنسهای مختلف خانواده سیب زمینیسانان از جمله، Atropa،Hyoscyamus، Datura، Duboisia، Scopolia وBrugmansia سنتز میشوند.[5-4-3]
تروپان آلکالوئیدها ترکیبات سمی هستند که میتوانند بر سلامت انسان و حیوان تأثیر بگذارند بهطوریکه مواد غذایی انسانی یا خوراک دام آلوده به این ترکیبات باعث مسمومیت شدید در آنها میشوند .[3] هیوسیامین و اسکوپولامین دو ترکیب اصلی از تروپانآلکالوئیدهای خانواده سیب زمینیسانان میباشند[6]، اسکوپولامین با ارزشترین تروپان آلکالوئید جهان است [.7] هیوسیامین2 و اسکوپولامین 3 از نظر دارویی جزء تروپان آلکالوئید های مهم هستند که به طور منحصر به فرد توسط گیاهان تولید می شوند و به طور پیوسته تقاضای صنعتی زیادی برای آنها وجود دارد. این ترکیبات به دلیل تاثیر بر سیستم اعصاب مرکزی و فعالیت های آنتی کلینرژیک4 در زمینه های گوناگون مانند بیماری های چشم قلب معده و روه ضد اسپاسم و ضد درد... مورد استفاده قرار گرفته و به عنوان داروهای مهار کننده اعصاب پاراسمپاتیک کاربرد دارند[6-5]
این ترکیبات به طورمعمول درریشه های جوان تولید و به اندامهای هوایی گیاه منتقل میشوند .[8] از آنجا که سنتز شیمیایی این آلکالوئیدها مشکل میباشد و از لحاظ اقتصادی مقرون به صرفه نیست لذا برای تأمین نیاز صنعت داروسازی به طور انحصاری از منابع گیاهی جداسازی و تهیه میشوند. اسکوپولامین نسبت به هیوسیامین تأثیر قویتری بر سیستم اعصاب مرکزی داشته و اثرات جانبی نامطلوب کمتری برجای میگذارد و تقاضای جهانی برای استفاده از آن حدود 10 برابر بیشتر از هیوسیامین و آتروپین5 است.[7-5] بر اساس تنها تحقیق انجام شده بر گونههای H.orthocarpus و H.kotschyanus که توسط فتاحی و همکاران - 1394 - گزارش شده است؛ ریشه گیاهان مادری حاوی مقادیر بالای هیوسیامین و اسکوپولامین هستند که میتواند به عنوان مهمترین آلکالویید در صنایع دارویی مورد استفاده قرار گیرد. ریشههای مویین که از آلوده شدن گیاهان با اگروباکتریوم رایزوژنز6 تولید میشوند به عنوان متداولترین روشها برای تولید متابولیتهای ثانویه شناخته شدهاند[9]،
سویه های بیماری زای این باکتری با انتقال قسمتی از پلاسمید - Ri - خود، به نام T- DNA به ژنوم گیاه میزبان باعث ایجاد ریشه مویین می شود .[10-9] استفاده از این روش برای تولید ترکیبات دارویی خاص با مقدار مشابه یا بیشتر از گیاه مادری در چند سال گذشته افزایش یافته است. برای بالا بردن بهره برداری تجاری تلاشهای زیادی در زمینه کشت بافت و بیوسنتز انجام شده است. کشت ریشه مویین در جهت تولید متابولیتهای ثانویه تحولی اساسی را ایجاد کرد. این روش از نظر ژنتیکی و بیوشیمیایی پایدار میباشد و در محیط کشت بدون هورمون رشد می کند و در کمترین زمان ریشه های مویین فراوانی را تولید میکند .[13-12-11-9] ویژگی های ریشه های مویینی که توسط سویه های مختلف اگروباکتریوم رایزوژنز تولید شده بود بسته به نوع گیاه، نوع سوش و آزمایشات و شرایط آزمایشگاهی از کلونی به کلون دیگر متفاوت بود.[4]
بنابراین با توجه به اهمیت این گونه که حاوی مقادیر بالایی از تروپان آلکالوئیدهای هیوسیامین و اسکوپولامین است القاء و تولید ریشه مویین در آن میتواند روشی موثر در تولید تروپان آلکالوئیدها و رفع نیاز صنایع دارویی - باشد. در این پژوهش امکان تولید ریشه مویین در گونه Hyoscyamus muticus با استفاده از سویه های A4 و LBA9402 اگروباکتریوم رایزوزنز بر روی برگ گیاه و در محیط کشت,1B5 مورد بررسی قرار گرفت. تحقیقات انجام شده توسط Sujatha و همکاران - 2013 - نشان داد که از بین سویههای اگروباکتریوم رایزوژنز A4، R1000،R1601، ATCC15834، بهترین سویه برای رشد ریشه مویین گیاه Artemisia vulgaris ، A4 بود. همچنین Sauerwein و - 1991 - Koichiro بیان کردند ریشه مویین گیاه Hyoscyamus Albus بیش از 30 میلیگرم تروپان آلکالویید در 50 میلیلیتر محیط کشت مایع تولید کرده است و همچنین مطالعات Sharafi و همکاران - 2013 - نشان داد که ریشه مویین گیاه Papaver bracteatum نسبت به گیاه مادری مورفین بیشتری را تولید کرده است. تحقیقات صورت گرفته توسط akramian و همکاران - 2008 - در گونه های Hyoscyamus از بین سویه های 2659 - ،1724 ،15834، A4 و - LBA9402 بهترین سویه برای تولید ریشه مویین سویه های - 15834, - 2659, LBA 9402 بود.
مواد و روش ها
مواد گیاهی:
تحقیق حاظر روی گونه ای از جنس بنگ دانه ایران شامل بنگدانه Hyoscyamus muticus انجام شد. بذر های این گونه ها از بخش بانک ژن موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور تهیه شد. ابتدا بذور به منظور شکست خواب بذر و تسریع در جوانه زنی به مدت 12 ساعت در اسید جیبرلیک با غلظت 200 میلی گرم بر لیتر تیمار شد. سپس در سینی کشت حاوی کوکو پیت کشت شدند و در اتاق کشت تحت دمای 25 درجه سانتیگراد،16 ساعت روشنایی 8 ساعت تاریکی قرار داده شدند. در نهایت گیاهچه ها در مرحله 2 الی 3 برگی به گلدان های پلاستیکی حاوی کوکوپیت منتقل شدند.
سویه های باکتری:
سویههای مورد استفاده در این مطالعه LBA 9402 و A4 اگروباکتریوم رایزوژنز که از دانشگاه بارسلون کشور اسپانیا تهیه شده است در محیط کشت جامد YEB در دمای 28 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت کشت داده شد.[14]
