بخشی از مقاله

چکیده

ریشههای مویین القا شده به وسیلهی باکتری Agrobacterium rhizogenes به علت پایداری و تولید زیاد ریشهها در شرایط کشت بدون هورمون و در زمان کوتاه، بافتی مناسب برای تولید متابولیتهای ثانویه است. شنبلیله از جمله گیاهان دارویی ارزشمند از تیرهی Fabaceae میباشد. برگهای شنبلیله حاوی کلسیم، آهن، فسفر، کاروتن، اسیدآسکوربیک، پروتئین، تیامین و ریبوفلاوین میباشد. همچنین این گیاه به طور گستردهای بهعنوان گیاه ضددیابت، پایین آورندهی قند خون و کلسترول، ضدسرطان، ضدباکتری و چاشنی غذا مورد استفاده قرار میگیرد. در این تحقیق، ریشههای مویین از طریق ریزنمونهی گیاهچهی کامل و کوتیلدون و هیپوکوتیل به روش تزریقی توسط A. rhizogenes سویههای A4، ATCC11325 و ATCC15834 تولید شدند. تأثیر نوع سویه باکتری و نوع ریزنمونه - گیاهچهی کامل، هیپوکوتیل و کوتیلدون - برکارایی ریشههای مویین بررسی شد. ریز نمونهها در محیط کشت B5در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی در چهار تکرار کشت شده و ریشههای مویین بعد از گذشت دو الی سه هفته در ریزنمونههای تلقیح شده با باکتری ظاهر شدند. بیشترین میزان تراریختی 93 - درصد - و تعداد ریشههای مویین 10/43 - عدد ریشه - و بیشترین طول ریشه 6/64 - سانتی متر - در ریزنمونه گیاهچهی کامل 10 روزه و سویه A4 مشاهده شد و در ریزنمونهی هیپوکوتیل در هر سه سویه ریشههای مویین مشاهده نشد.

واژههای کلیدی: شنبلیله، ریشههای مویین، اگروباکتریوم رایزوژنز، متابولیتهای ثانویه

مقدمه

گیاهان دارویی یکی از مهمترین منابع دارویی میباشند که از هزاران سال پیش کاربرد داشتهاند. ویژگی دارویی برخی از گیاهان به علت وجود ترکیبات متنوعی است که متابولیتهای ثانویه نامیده میشوند . - Chaudhuri et al., 2005; Wu et al., 2007 - با توجه به اینکه در طبیعت سرعت تولید متابولیت های ثانویه آهسته بوده و مدت زمان طولانی برای تولید آنها لازم است، بنابراین تولید متابولیتهای دارویی با استفاده از گیاهان وحشی اقتصادی نبوده و به نظر می رسد که برای تولید سریع و انبوه آنها بهتر است که از فنون کشت سلول و بافت گیاهی به طور بهینه استفاده شود . - Ionkova., 2007 - بررسیها نشان داده است که میزان متابولیتهای ثانویهی موجود در گیاهان کشت بافت شده خیلی بیشتر از میزان آن در گیاه طبیعی است و حتی سلولهای گیاهان کشت بافت شده، متابولیتهایی تولید می کنند که در گیاه اولیه تولید نمیشود.

اگروباکتریوم رایزوژنز یک باکتری خاکزی است که موجب تولید ریشه مویین در محل زخم میشود. انتقال ناحیه T-DNA موجود در پلازمید Ri از این باکتری به سلولهای گیاهی موجب القای ریشههای نابجا با انشعابات فراوان و کرک مانند موسوم به ریشههای مویین میشود. طی سالهای اخیر کشت ریشههای مویین به منظور تولید متابولیتهای با ارزش در تعدادی از گونههای گیاهان دارویی در مقیاس تجاری صورت گرفته است . - Yang et al., 2011 - استفاده از A. rhizogenes و

کشت ریشههای مویین به علت رشد سریع، زمان دو برابر شدن کوتاه، سهولت نگهداری و توانایی سنتز گسترهای از ترکیبات شیمیایی مزیتهای بیشتری را به عنوان یک منبع پیوسته برای تولید متابولیتهای ثانویه ارزشمند
ایجاد مینماید . - Giri and Narasu., 2000 - رویکرد روزافزون استفاده از گیاهان دارویی و فرآوردههای حاصل از آن نقش این گیاهان را در چرخهی اقتصادی جهانی پررنگتر کرده، بهطوری که مصرف رو به افزایش آنها تنها به کشورهای در حال توسعه محدود نبوده بلکه در کشورهای پیشرفته نیز توسعهی فراوانی یافتهاند - Anwar . - et al., 2005 یکی از این گونههای دارویی با ارزش، گیاه شنبلیله است که بومی ایران بوده و از گذشته بهعنوان گیاه دارویی مصرف شده است.گیاه شنبلیله با نام
علمی    از تیرهی

بقولات بوده و گیاهی علفی، یکساله و ارتفاع آن تا 50 سانتیمتر میباشد که بهعنوان یک گیاه دارویی، زراعی، مرتعی، آرایشی و بهداشتی حائز اهمیت فراوان است - نجفپور نوایی، . - 1373 دانهها به رنگ زرد نارنجی و گاهی قهوهای رنگ است. شنبلیله بهعنوان یک سبزی، گیاه دارویی و ادویهی معطر خوراکی، مهم بوده که برگهای تازه، خشک شده و همچنین بذرهای آن مورد استفاده قرار می گیرد. برگهای شنبلیله حاوی کلسیم، آهن، فسفر، کاروتن، اسیدآسکوربیک، پروتئین، تیامین و ریبوفلاوین میباشد. همچنین این گیاه به طورگستردهای بهعنوان گیاه ضد دیابت، پایین آورندهی قندخون و کلسترول، ضدسرطان، ضد باکتری و چاشنی غذا مورد استفاده قرار میگیرد - Sadeghzadeh-Ahari et al., 2009 بنابراین ضروری به نظر میرسد که از فنون کشت بافت برای ریشهزایی بهینهی این گیاه استفاده به عمل آید. به همین دلیل در این پژوهش، با استفاده از سویههای A4، ATCC11325 و ATCC15834

اگروباکتریوم رایزوژنز ، ریشهزایی گیاه دارویی شنبلیله در شرایط درون شیشهای مورد آزمون قرار گرفت.

مواد و روشها

مواد گیاهی و تهیه ریز نمونه

بذر گیاه شنبلیله از شرکت آرتان بذر تبریز تهیه شد. به منظور استریل نمودن، بذور در زیر هود لامینار به مدت 1 دقیقه دراتانول 70 درصد وسپس به مدت 10 دقیقه درهیپوکلریت سدیم 2/5 درصد ضدعفونی شدند و پس ازسه بار آبکشی با آب مقطر استریل درمحیط کشت MS

- Murashige and Skoog., 1962 - جامد کشت و در دمای 25 ±2 oc و درشرایط نوری 16ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگهداری شدند. از گیاهچهی کامل، هیپوکوتیل و کوتیلدون 10 روزه به عنوان ریزنمونه برای تلقیح با باکتری استفاده گردید.

آمادهسازی سویه باکتری و تلیقح ریزنمونهها با
اگروباکتریوم رایزوژنز

به منظور القای ریشههای مویین، از سویههای A4، ATCC11325 و ATCC15834 اگروباکتریوم رایزوژنز

استفاده شد. سویهی باکتری در محیط کشت LB - Bertani, 1952 - مایع حاوی 50 میلیگرم در لیتر آنتی بیوتیک ریفامپسین کشت و بر روی شیکر با سرعت 110 دور در دقیقه و در دمای 26 درجه سانتی گراد قرار داده و بعد ازگذشت 24 ساعت برای تلقیح ریزنمونهها استفاده شد. برای آلوده کردن گیاهچه ها و ریز نمونهها از روش تزریق با سوزن سرنگ انسولین استفاده شد. در مرحلهی بعد ریزنمونههای تلقیح شده به محیط کشت B5 انتقال داده شدند و به مدت 72 ساعت در تاریکی قرار گرفتند. نمونه شاهد نیز بدون تلقیح با باکتری در محیط کشت قرار گرفت. این پژوهش بصورت فاکتوریل و در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی با 4 تکرار انجام شد. سه روز بعد از هم کشتی، ریز نمونهها به منظور حذف باکتری به محیط B5 جامد حاوی 500 میلی گرم در لیتر آنتی بیوتیک سفوتاکسیم منتقل شدند وکشت ها در فواصل دو هفتهای تا حذف کامل باکتری واکشت شدند. ریشههای مویین
بعد از گذشت دو الی سه هفته ظاهر شدند. پس از ظهور چهار هفته از ظهور ریشهها، درصد القای ریشههای مویین، تعداد و طول ریشهها محاسبه گردید.

آنالیز مولکولی ریشهها از طریق واکنش زنجیرهای پلی مراز - PCR -

استخراج DNA ژنومی ریشه های مویین و طبیعی به روش CTAB انجام شد. به منظور آنالیز مولکولی تایید حضور قطعه T-DNA پلاسمید Ti در ریشهها از پرایمر های ژن rolB، با توالی آغازگرها به صورت زیر بود: 5'-

ATGGATCCCAAATTGCTATTCCCCACGA-3' - آغازگر مستقیم - و 5'-

TAGGCTTCTTTCATTCGGTTTACTGCAGC 5'--3' - آغازگر معکوس - . برنامه ی PCR شامل یک چرخه
واسرشتگی اولیه در دمای 94 œc به مدت 5 دقیقه، 35 چرخه شامل واسرشتگی در دمای 94 °c با مدت 1 دقیقه، اتصال آغازگرها در دمای 58 œc به مدت 1 دقیقه، بسط در دمای 72 œc به مدت 1 دقیقه و یک چرخه بسط نهایی در دمای 72 œc به مدت 1 دقیقه بود. محصولات PCR پس از الکتروفورز در ژل آگارز 0/8 درصد در دستگاه ژل داک مورد مشاهده و عکسبرداری قرار گرفتند.

تجزیه و تحلیل آماری    
تجزیه و تحلیل آماری داده ها با استفاده از نرم    افزار
SPSS 16 و رسم نمودارها توسط نرم افزار Excel    انجام
گردید.    
نتایج و بحث    

تاثیر نوع ریزنمونه و نوع سویه باکتری در میزان القای ریشههای مویین

در متن اصلی مقاله به هم ریختگی وجود ندارد. برای مطالعه بیشتر مقاله آن را خریداری کنید