بخشی از مقاله
چکیده:
هدف از این پژوهش یافتن منابع نیتروژنی است که علاوه بر افزایش میزان رشد باکتري Pseudomonas fluorescence استرین UTPf61 که یک عامل بیوکنترل براي قارچ Sclerotinia sclerotiorum محسوب می شود باعث افزایش کارایی بیوکنترل شود و در عین حال از نظر اقتصادي در مقیاس تولید نیمه صنعتی و صنعتی امکان پذیر باشد.
دانستن فاکتورهاي محیطی مانند منابع نیتروژن که روي استرین هاي بیوکنترلی سودوموناس فلورسنس موثر می باشند یک گام اساسی به سمت بهبود و اطمینان از فعالیت بیوکنترلی آنها می باشد. در این تحقیق جدایهUTPf61 از میان 40 جدایه بر اساس آزمون هاي هاله بازدارندگی، سیانید هیدروژن، پروتئاز و تاثیر بر روي فاکتور هاي رشدي گیاه آفتابگردان در شرایط گلخانه انتخاب شد.
بررسی میزان رشد این جدایه در هشت محیط کشت با منابع ازت مختلف شامل: اوره، سولفات آمونیوم، پپتون، نیترات آمونیوم، فسفات آمونیوم، دي آمونیوم هیدروژن فسفات، عصاره ذرت و اوره + سولفات آمونیوم نشان داد که محیط هاي پپتون، دي آمونیوم هیدروژن فسفات، سولفات آمونیوم+ اوره و سولفات آمونیوم در مقایسه با سایر محیط ها در افزایش جمعیت باکتري تاثیر بیشتري دارند.
در بررسی اثر محیط کشت روي کارایی باکتري در شرایط آزمایشگاه ، محیط هاي کشت فسفات آمونیوم، نیترات آمونیوم و اوره بیشترین تاثیر را در جلوگیري از رشد میسیلیومی قارچ نشان دادند.
مقدمه:
باکتري هاي آنتاگونیست خصوصا سودوموناس هاي فلورسنس با تولید یکسري متابولیت هاي ضد میکروبی و آنتی بیوتیک، سیانید هیدروژن، سیدروفور، پروتئاز، پدیده رقابت و ... نقش موثري در کنترل بیماریهاي خاکزي دارند. فاکتورهاي محیطی از جمله عواملی هستند که بر روي فعالیت عوامل بیوکنترل موثر می باشند و همچنین در تنظیم بیوسنتز ترکیبات ضد میکروبی نقش مهمی ایفا می کنند.
از طرفی یکی از مهمترین مسائل در مورد استفاده عملی از عوامل بیوکنترل در سطح وسیع تولید آنها به مقدار زیاد می باشد همچنین طراحی فرایندي که بتواند علاوه بر افزایش بیومس همزمان کارایی، ماندگاري و ثبات ژنتیکی باکتري را در مراحل تولید انبوه افزایش دهد از اهمیت بسزایی برخوردار است.
به علاوه عناصر غذایی پرمصرف و کم مصرف موجود در شرایط طبیعی و محیط کشت در بقا و کارایی عامل بیوکنترلی نقش بسزایی دارند. طبق بررسی هاي کوستا و همکاران - - 1 براي پیدا کردن بهترین منبع ازت که حداکثر بیومس Pantoea agglomerans را ایجاد کند عصاره مخمر به عنوان بهترین منبع نیتروژن شناخته شد.
آیر - - 3 نشان داد که فسفات پپتون و آمونیوم هیدروژن به ترتیب بهترین منابع آلی و غیرآلی نیتروژن می باشند. همچنین در پژوهشی دیگر مشخص شد که بیشترین سطح تولید پلی بتا هیدروکسی بوتیرات 1توسط برخی گونه هاي باکتري باسیلوس در محیط کشت حاوي پروتئاز پپتون ایجاد می شود
از آنجا که آفتابگردان یکی از گونه هاي گیاهی است که به قارچ Sclerotinia sclerotiorum حساس است و هیچ برنامه اي براي گسترش مقاومت به پوسیدگی اسکلروتینیایی در آفتابگردان انجام نشده است و هیچ کنترل شیمیایی موثري براي این بیماري شناخته نشده است
استفاده از عوامل بیوکنترل علیه این قارچ می تواند موثر باشد. شواهد نشان می دهد که تلقیح دانه ها با باکتري آنتاگونیست بطور موثري بر روي رشد گیاه بوسیله حفاظت بذور و حفاظت علیه پاتوژن هاي خاکزاد موثر است - . - 4 تعدادي از استرین هاي گونه هاي Pseudomonas fluorescence و P. putida به عنوان عوامل بیوکنترلی قارچ هاي مختلف خاکزاد گزارش شده اند
هدف از این پژوهش یافتن منابع نیتروژنی است که علاوه بر افزایش میزان رشد باکتري P. fluorescence استرین UTPf61 که یک عامل بیوکنترل براي قارچ S. sclerotiorum محسوب می شود باعث افزایش کارایی بیوکنترل شود و در عین حال حداقل قیمت را نیز دارا باشد که در مقیاس تجاري این موضوع حائز اهمیت است.
مواد و روش ها:
-1 جداسازي باکتري: از میان 40 جدایه باکتريP. fluorescence جدایه UTPf61 بر اساس تست هاله بازدارندگی، سیانید هیدروژن، پروتئاز و تاثیر بر روي رشد رویشی در گلخانه انتخاب و براي آزمایش هاي بعدي بکار برده شد.
-2 محیط هاي کشت مورد استفاده: محیط پایه اي که در اینجا استفاده شده محیط M1 با حداقل عصاره مخمر می باشد - 5 - که شامل مواد زیر می باشد:
سپس منابع ازت آلی و غیرآلی مختلف به این محیط پایه بطور جداگانه اضافه شد که این منابع نیتروژن شامل موارد ذیل بودند:
اوره - 4گرم بر لیتر - ، سولفات آمونیوم - 4گرم بر لیتر - ، پپتون - 4گرم بر لیتر - ، نیترات آمونیوم - 4گرم بر لیتر - ، فسفات آمونیوم - 4گرم بر لیتر - ، دي آمونیوم هیدروژن فسفات - 4گرم بر لیتر - ، عصاره ذرت4 - 1گرم بر لیتر - و اوره - 2 گرم بر لیتر - + سولفات آمونیوم - 2گرم بر لیتر - .
-3 آماده سازي محیط کشت و مایه زنی با سوسپانسیون باکتري: ابتدا درون فلاسک هاي 100 میلی لیتري به میزان 50 میلی لیتر از هر کدام از محیط هاي کشت در 3 تکرار ریخته شد و محیط ها به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شدند. سپس از کشت 24 ساعته باکتري آنتاگونیست غلظت 1×106 سلول باکتري در هر میلی لیتر محاسبه شد و به میزان یک میلی لیتر به هر کدام از فلاسک هاي حاوي محیط کشت استریل، تحت شرایط کاملا استریل اضافه شد. سپس فلاسک ها به مدت 48 ساعت درون شیکر- انکوباتور در دماي 25 درجه سانتیگراد و 100دور در دقیقه قرار گرفتند.
-4 تعیین جمعیت باکتري: رشد باکتریایی بطور مستقیم با اندازه گیري بوسیله اسپکتوفتومتریک با جذب نوري600 2 نانومتر با استفاده از یک اسپکتوفتومتر Ulterospec П و نتایج در قالب طرح فاکتوریل مورد تجزیه و تحلیل آماري قرار گرفتند و مقایسه میانگین ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح P≤0.01 انجام شد.
-5 بررسی کارایی جدایه باکتري حاصل از محیط کشت هاي مختلف: جدایه باکتري حاصل از هر کدام از محیط کشت ها به شکل 2نقطه روي تشتک هاي محتوي PDA در 3 تکرار قرار گرفت و پس از گذشت 48 ساعت قطعات مساوي از کشت 5 روزه قارچ در وسط تشتک ها قرار گرفت و پس از گذشت 7 روز هاله بازدارندگی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج در قالب طرح فاکتوریل مورد تجزیه و تحلیل آماري قرار گرفتند و مقایسه میانگین ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح P≤0.01 انجام شد.
نتایج و بحث:
همانطور که در جدول 1 آورده شده محیط هاي پپتون، دي آمونیوم هیدروژن فسفات، سولفات آمونیوم+ اوره و سولفات آمونیوم در مقایسه با سایر محیط ها در افزایش جمعیت باکتري تاثیر بیشتري نشان دادند و کمترین رشد سلولی در محیط حاوي عصاره ذرت صورت گرفت. همچنین در بررسی اثر محیط کشت روي کارایی باکتري در شرایط آزمایشگاه مشخص شد که محیط هاي کشت فسفات آمونیوم، نیترات آمونیوم و اوره در کشت دو نقطه به ترتیب با هاله بازدارندگی 15.6 و 15.3 میلی متر بیشترین تاثیر را در جلوگیري از رشد میسیلیومی قارچ نشان دادند و اختلاف معنی داري با سایر محیط ها نشان دادند و محیط هاي دي آمونیوم هیدروژن فسفات و سولفات آمونیوم کمترین تاثیر را روي قارچ داشتند.
با توجه به نتایج تحقیق حاضر، محیط هاي کشت تاثیر متفاوتی در میزان رشد سلولی و کارایی باکتري نشان می دهند. هر چند محیط هاي باعث بیشترین میزان رشد سلولی شدند اما در حفظ کارایی باکتري اثر منفی نشان دادند. بنابراین نوع مواد به کار رفته در محیط کشت ممکن است در میزان جمعیت و یا کارایی عامل بیوکنترل میکروبی مفید باشند ولی موادي که براي بهینه سازي یکی از خصوصیات باکتري در فرایند تولید انبوه به کار می رود لزوما با دیگر اهداف آن سازگاري ندارد.
در ضمن جزئیات محیط هاي کشت تجاري موجود در برخی کشور هاي توسعه یافته در دسترس نیست و حالت محرمانه دارد. بنابراین وظیفه ماست تا با تحقیق و پژوهش بیشتر در مورد مکمل هاي غذایی و بهبود مراحل فرمانتاسیون، به تکنولوژي تولید انبوهی دست یابیم که از نظر حفظ قدرت حیات و افزایش کارایی عوامل آنتاگونیست بسیار موثر بوده و رضایت بخش باشد تا در نهایت عامل آنتاگونیست به صورت انبوه و تجاري تولید شده و در اختیار کشاورزان قرار گیرد.
جدول-1 تاثیر منابع مختلف نیتروژن روي جمعیت و کارایی باکتريP. fluorescence استرین UTPf61 در دماي 25
