بخشی از مقاله
چکیده:
تولید آنزیمهای زایلاناز به دلیل کاربردهای فراوانی که در صنایع مختلف همانند آنزیمهای خوراکی در تغذیه دام، زیست رنگبری خمیر کاغذ و ... از منابع قارچی و باکتریایی امکان پذیر است. یکی از فعالترین جدایههای قارچی از نظرتولید آنزیم Trichoderma reesei و Trichoderma harzianum میباشد که در این تحقیق با ایجاد موتاسیون مستقیم در ژنوم قارچ به منظور افزایش فعالیت آنزیم زایلاناز فعالیت این آنزیم در دما و pH مناسب بررسی شد.
در این مطالعه القاء جهش در T.reesei و T.harzianum با دز اپتیمم 250 گری انجام شد و پس از آمادهسازی سوبسترا و القاء آنزیم زایلاناز در جدایههای موتانت فعالیت زایلانازی 41 جدایه موتانت حاصل اندازهگیری شد که در این بررسی دو جدایه موتانت T.hM3 و T.rM17 با فعالیت ویژه آنزیمی 20/26 و 6/66 واحد در میلیلیتر فعالترین جدایهها و جدایه T.hM11 و T. rc با فعالیت ویژه آنزیمی 0/59 و 0/62 واحد در میلیلیتر ضعیف ترین جدایهها بودند. در 65/5 درصد جدایهها ایجاد جهش در اثر پرتوتابی با اشعه گاما منجر به افزایش فعالیت زایلاناز شد.
مقدمه:
آنزیم زایلاناز کاربرد و اهمیت اقتصادی فراوانی دارد همانند استفاده به عنوان آنزیم خوراکی در جیره غذایی حیوانات، زیست رنگبری خمیر کاغذ، صنعت منسوجات، تولید زایلو اولیگوساکاریدها، تصفیه فاضلاب و... . یکی از فعالترین جدایههای قارچی از نظر تولید آنزیم Trichoderma reesei و Trichoderma harzianum هستند .[1]هدف از انجام این مطالعه افزایش تولید آنزیم زایلاناز در این دو گونه آنزیمی قارچ تریکودرما ایجاد جهش با استفاده از پرتو گاما بود.
مواد و روشها:
قارچ Trichoderma reesei به صورت لیوفیلیزه از مرکز کلکسیون قارچ و باکتری سازمان پژوهش های علمی و صنعتی ایران به شماره 5142 تهیه شد و قارچ Trichoderma harzianum از اطراف مزارع چغندر قند خراسان جداسازی شده است. قارچهای فوق روی محیطکشت PDA منتقل شد.
دزیابی و پرتوتابی به منظور القاء موتاسیون در قارچ تریکودرما: به منظور ایجاد جهش در قارچهای تریکودرما رسئی و هارزیانوم، عملیات دزیابی و پرتوتابی در پژوهشکده کشاورزی هستهای - سازمان انرژی اتمی ایران - انجام شد .[2] پس از ایجاد جهش و تهیه جدایههای جهش یافته خالص سازی شده، فعالیت آنزیم زایلاناز اندازهگیری شد.
القاء تولید آنزیم زایلاناز در جدایههای جهش یافته قارچ تریکودرما: جهت القاء آنزیم زایلاناز تعداد 21 جدایه جهشیافته قارچ تریکودرما رسئی و 20 جدایه جهش یافته تریکودرما هارزیانوم در محیط MYG کشت داده شد. برای انجام سنجش آنزیمی از سوسپانسیون به محیط کشت [3],TCM - Trichoderma complete medium - تا اسپورها به مسلیوم تبدیل شوند بعد مسیلیومها با استفاده از دستگاه سانتریفوژ از محیط کشت TCM جدا و جهت القاء آنزیم زایلاناز به محیط کشت [3]TFM - Trichoderma Fermentation medium - که حاوی زایلان 0/5درصد - وزنی/حجمی - به عنوان سوبسترا جهت القاء آنزیم زایلاناز اضافه شد. میسلیومهای قارچ توسط سانتریفوژ کردن خارج و از مایع فوقانی برای اندازهگیری فعالیت آنزیمی استفاده شد. تعیین فعالیت آنزیم زایلاناز با استفاده از معرف DNS - اسید دی نیتروسالیسلیک - برحسب میزان قند احیا آزاد شده در حین فعالیت آنزیمی انجام شد.
سنجش فعالیت آنزیم زایلاناز: سنجش آنزیمی جدایههای جهش یافته انجام شد [4] و میزان جذب نمونهها با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر در طول موج540 نانومتر خوانده شد.
اندازهگیری غلظت پروتئین خارج سلولی: برای اندازهگیری مقدار پروتئین از روش Bradford - بردفورد، - 1976 که در آن از پروتئین BSA1 بعنوان استاندارد استفاده شد .[4] جذب پروتئین با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 595 نانومتر قرائت شد.آماده سازی ژل SDS PAGE جهت تعیین وزن مولکولی آنزیم زایلاناز: مایع فوقانی TFM و از استون جهت ترسیب پروتئین استفاده شد .[4] وزن مولکولی آنزیم زایلاناز سدیم دو دسیل سولفات پلی آکریل آمید ژل الکتروفورز با استفاده از روش - 1970 - Laemmli تعیین شد
آنالیز آماری دادههاکلیه: آزمایشات در قالب طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام شد و آنالیز آماری با استفاده از نرم افزار SPSS و روش ANOVA و مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون دانکن و سطح احتمال 5 درصد صورت گرفت.
نتایج:
بررسی میزان تولیدآنزیم زایلاناز: نتایج فعالیت آنزیم زایلاناز در مایع فوقانی تخمیر TFM بعد از 72 ساعت گرمخانهگذاری با سوبسترای پسلیوم حاصل از جدایههای جهش یافته تریکودرما رسئی و تریکودرما هارزیانوم در نمودار 1 نشان داده شده است.
نتایج دلالت بر تنوع در مقادیر فعالیت آنزیمی در جدایههای موتانت قارچ ترکودرما رسئی و هارزیانوم داشت. این مقادیر دارای اختلاف معنیدار آماری در سطح 0/05 بودند. بررسی فعالیت جدایههای مورد مطالعه نشان میدهد که از نظر فعالیت آنزیم زایلاناز در جدایههای جهش یافته قارچ تریکودرما هارزیانوم 5 جدایه 25 - درصد از جدایهها - میزان فعالیت آنزیم زایلاناز بیشتری نسبت به جدایه شاهد داشتهاند.
در این بین جدایه T.hM3، T.hM4، T.hM5، T.hM7 و T.hM8 اختلاف بیشتری - P<0/05 - با شاهد داشتند. جدایه T.hM3 با 20/26 واحد در میلیلیتر بیشترین فعالیت آنزیمی و جدایه T.hM11 با فعالیت آنزیمی 0/59 واحد در میلیلیتر کمترین - P<0/05 - میزان فعالیت آنزیمی را نشان دادند. از بین 20 جدایه جهش یافته قارچ تریکودرما رسئی، 20 جدایه 100 - درصد از جدایهها - میزان فعالیت آنزیم زایلاناز بیشتری نسبت به جدایه شاهد داشتهاند. در این بین جدایههای T.rM9، T.rM10، T.rM13، T.rM17 و T.rM21 دارای اختلاف بیشتری - P<0/05 - با نمونه شاهد داشتند. جدایه T.rM17 با 6/66 واحد در میلیلیتر بیشترین فعالیت آنزیمی و جدایه T.rc با فعالیت آنزیمی 0/62 واحد در میلیلیتر کمترین - P<0/05 - میزان فعالیت آنزیم را نشان دادند.
نمودار-1 فعالیت آنزیم زایلاناز قارج تریکودرما رسئی و هارزیانوم و جدایههای موتانت آنها در مایع فوقانی محیط تخمیر بعد از 72 ساعت گرمخانهگذاری در 28 درجه سانتیگراد و 180 دور در دقیقه
