بخشی از مقاله
چکیده:
اووسیتهاي پستانداران در زمان تولد در مرحلهي دیپلوتن پروفاز اولین میوز متوقف هستند و به دنبال سرژ هورمون لوتئینه کننده، یا برداشت آنها از محیط فولیکولی به سمت متافاز دو پیش میروند. مشخص شده است که آدنوزین مونو فسفات حلقوي - cAMP - ترکیبی است که میتواند ادامهي میوز را متوقف کند و یا آن را به تاخیر بیاندازد. مواد مختلفی هستند که باعث تغییر در غلظت cAMP در شرایط برونتنی میشوند. در این مطالعه از IBMX که باعث مهار سنتز فسفودي استراز میشود، به منظور افزایش غلظت cAMP و تاثیر این افزایش بر ادامهي بلوغ هستهاي، در محیط کشت بلوغ اووسیت گوسفند استفاده شد.
بدین منظور از اووسیتهاي گوسفندي در فصل غیر تولیدمثلی و به همراه سه غلظت از 0 - IBMX، 0/5و 1 میلی مولار - استفاده شد. نتایج نشان میدهد که IBMX، در پایان 26 ساعت کشت، تشکیل اولین جسم قطبی را به طور معنیداري - P<0.05 - کاهش میدهد اما تاثیري بر انتقال مرحلهي GV به مراحل بالاتر ندارد. در واقع برخلاف اووسیت جوندگان، در اووسیت گوسفند افزایش غلظت cAMP تاثیري بر GV ندارد. نتایج نشان میدهد که سطوح cAMP احتمالا تاثیر عمیقی بر مراحل پایانی بلوغ هستهاي در اووسیت گوسفندي میگذارد.
مقدمه
چرخه ي سلولی میوز در اووسیت پستانداران طی دوران جنینی شروع شده و در زمان تولد در مرحلهي دیپلوتن اولین پروفاز میوز متوقف میشود .[1] این توقف در میوز ممکن است براي چند ماه تا چند سال، بسته به گونهي پستاندار طول بکشد. ادامهي میوز با شکسته شدن ژرمینال وزیکول - GVBD - مشخص میشود. بعد از GVBD اووسیت به سمت متافاز I و در نهایت متافاز II پیش میرود که مشخصهي این مرحله خروج اولین جسم قطبی است.
اووسیت این روند را ادامه نمیدهد مگر در دو حالت، یا بدنبال سرژ هورمون لوتئینه کننده - LH - و یا به دنبال برداشت اووسیت از داخل فولیکول احاطه کنندهي آن که داراي یکسري مهارکنندهها بر ادامهي میوز میباشد .[2] آدنوزین مونو فسفات حلقوي - - cAMP ترکیبی است که از ATP بوسیلهي فعالیت آدنیلات سیکلاز تولید میشود. cAMP تولید شده به زیر واحد تنظیمگر پروتئین کیناز A متصل میشود. این کیناز در فرایند بلوغ اووسیت پستانداران نقش دارد. از طرفی فسفودياستراز باعث کاهش سطح cAMP در سلول میشود
در اووسیت موش و موش صحرایی نقش کلیدي این ترکیب در کنترل میوزي به خوبی مشخص شده است. به طوري که سطوح بالاي آن میوز را در این گونهها متوقف کرده و کاهش سطح آن باعث از سرگیري بلوغ هستهاي میشود .
در مطالعات مختلف از ترکیبات متفاوتی جهت تغییر غلظت cAMP در اووسیت استفاده شده است. در بعضی از مطالعات از مهارکنندههاي فسفودياستراز، در بعضی دیگر از آنالوگهاي cAMP و در دیگر مطالعات از فعال کنندههاي آدنیلات سیکلاز براي افزایش غلظت این ترکیب در اووسیت استفاده شده است.
در این مطالعه از -3ایزوبوتیل-1 متیل گزانتین - IBMX - که با مهار فعالیت فسفودياستراز سبب افزایش غلظت cAMP میشود استفاده شد. در موش و موش صحرایی گزارش شده است که افزایش غلظت cAMP سبب مهار انتقال مرحلهي GV به GVBD میشود .[5] اما در گاو نتایج به گونهاي دیگر است و با افزایش غلظت این ترکیب در اووسیت، انتقال GV به GVBD رخ میدهد اما با چند ساعت تاخیر، به طوریکه در پایان دورهي کشت 24 - ساعت - تفاوتی بین این گروهها با گروه کنترل به لحاظ انتقال در این مرحله وجود نداشته است .[6] لذا هدف از این مطالعه بررسی تاثیر افزایش غلظت cAMP بر پیشرفت مراحل میوزي اووسیت گوسفند است.
مواد و روشها
جمعآوري تخمدان و انتخاب اووسیتها
تخمدانهاي گوسفندي در فصل غیرتولیدمثلی از یک کشتارگاه محلی جمعآوري و توسط یک فلاسک حاوي سرم فیزیولوژیک استریل - - %0/9 NaCl با دماي 38 درجه سانتیگراد که با آنتیبیوتیکها 100 IU/ml - پنیسیلین و 100µg/ml استرپتومایسین - مکمل شده بود در طی 1-3 ساعت به آزمایشگاه منتقل شدند. فولیکولهاي با قطر 2-5 mm با استفاده از سوزن شماره 20 که به یک پمپ خلا متصل شده بود آسپیره شدند.
کمپلکسهاي اووسیت-کومولوس - COC - توسط محیط شستشو - - TCM-199-HEPES که با FBS %5، پنیسیلین و استرپتومایسین مکمل شده بود جدا شدند. در این آزمایش اووسیتهاي با سیتوپلاسم یکنواخت و روشن و واجد حداقل 4 لایه سلولهاي کومولوس متراکم استفاده شدند. بلوغ برونتنی تودههاي کومولوس-اووسیت انتخاب شده 4 بار با محیط شستشو اولیه شسته میشدند و سپس براي بلوغ به پتري دیش- هاي پلاستیکی داراي قطرههاي 50µl محیط کشت که زیر روغن معدنی بودند منتقل میشدند و به مدت 26 ساعت در انکوباتور با دماي 38/5 درجه سانتیگراد، CO2 %5 و %95 رطوبت منتقل شدند. محیط کشت بلوغ مورد استفاده TCM-199 بود که با FBS %10، FSH 0/5 µg/ml، LH 5 µg/ml و پنیسیلین و استرپتومایسین مکمل شده بود.
براي ارزیابی بلوغ هستهاي، سلولهاي کومولوس اطراف اووسیت را به وسیلهي پیپت کردن برداشته و بمدت 24-48 ساعت در محلول اتانول: اسید استیک - - 1:3 تثبیت میشوند. در پایان این دوره، اووسیتها با اورسئین %2 رنگ آمیزي شده و زیر میکروسکوپ اینورت با بزرگنمایی 400 ارزیابی و مراحل بلوغ را به صورت زیر تقسیم شدند: .1 مرحلهي .2 GV مرحلهي متافازI و .3 مرحلهي متافاز II
- اثر غلظتهاي مختلف IBMX
اثر غلظتهاي مختلف 0 - IBMXو 0/5و 1 میلیمولار - بر روند ادامهي میوز آزمایش شده است. چنین غلظتهایی توسط بارتو1و همکاران - 2007 - و آکتاس٢ و همکاران - 1995 - در کشت اووسیتهاي گاوي استفاده شده است. آنالیز آماري نتایج اثر IBMX بر بلوغ هستهاي با استفاده از آزمون کاي اسکوار ارزیابی شد و بدین منظور از نرم افزار SAS نسخهي 9.12 و رویهي GENMOD استفاده گردید.
نتایج و بحث
هدف از این مطالعه تعیین اثر یک مهارکنندهي فسفودي استراز بر بلوغ برونتنی اووسیتهاي گوسفند بود. همانطور که در جدول 1 مشاهده میشود، بعد از 26 ساعت کشت، IBMX در هر دو غلظت 0/5 - و 1 میلی مولار - بلوغ میوزي را متوقف میکند و نسبت به گروه کنترل، بطور معنیداري از خروج اولین جسم قطبی که لازمه متافاز II است جلوگیري میکند
نتایج این مطالعه با دیگر مطالعات در موش [1]، گاو [6, 7] و [8] catfish مطابقت دارد. این ماده - IBMX - ترکیبی است که با مهار آنزیم فسفودي استراز باعث افزایش غلظت cAMP در اووسیت میشود. نشان داده شده است که افزایش غلظت cAMP باعث تغییراتی در فعالیت پروتئین کیناز A میشود که این کیناز نقش کلیدي را در کنترل میوز تعدادي از پستانداران بویژه موش و موش صحرایی بازي میکند
همانطور که در جدول مشاهده میشود، IBMX در پایان این دورهي 26 ساعته، در هیچ یک از دو غلظت تاثیري بر GV نداشته و بین اووسیتهایی که دستخوش GVBD شدهاند در هیچکدام از گروهها تفاوتی دیده نشد. این نتیجه نیز با نتایج بدست آمده در گاو یکسان بود، بطوریکه سیرارد و همکاران - 1988 - - که در آزمایش خود از آنالوگ cAMP استفاده کردند - و همچنین بارتو و همکاران - 2007 - نشان دادند که افزایش cAMP در اووسیت باعث تاخیر در ادامهي بلوغ در ساعات اولیه کشت میشود اما در پایان 24 ساعت بین تیمارها هیچ تفاوتی بین اووسیتهاي مرحلهي GV وجود نداشت.
در پایان، نتایج این مطالعه نشان میدهد که سطوح cAMP درون اووسیت احتمالا تاثیر عمیقی بر بلوغ کامل اووسیت گوسفندي دارد و با افزایش این ترکیب در اووسیت، گرچه انتقال GV به مراحل بالاتر صورت میگیرد اما مراحل پایانی میوز - انتقال متافاز I به متافاز - II متوقف میشود.
