بخشی از مقاله
چکیده
تعداد پایین رویانهای بدست آمده از کشت برون تنی، میتواند بواسطهی بلوغ سیتوپلاسمی ناکامل در اووسیت پستانداران باشد.
هماهنگی بین بلوغ هستهای و سیتوپلاسمی شایستگی اووسیت را برای تولید رویان در شرایط برونتنی بهبود میبخشد. این هماهنگی با کند یا متوقف کردن بلوغ هستهای بدست میآید. گزارش شده است که روسکوویتین - ROS - و -3 ایزو بوتیل -1 متیل گزانتین - IBMX - میتوانند بلوغ میوزی را در اووسیت پستانداران مهار کنند. به نظر میرسد گزارشی در مورد تاثیر این دو ترکیب بر بلوغ اووسیت گوسفند وجود ندارد. بنابراین هدف از مطالعه حاضر بررسی تاثیر غلظتهای مختلف روسکوویتین 12/5 - و 25 میکرومولار - و 0/5 - IBMX و 1 میلیمولار - بر ادامهی بلوغ میوزی اووسیتهای گوسفند بود. بعد از 26 ساعت کشت، نتایج نشان میداد که هر دو ترکیب قادر به مهار بلوغ میوزی اووسیت گوسفند بودند. به هر حال بالاترین غلظت روسکوویتین توانست اووسیتها را در مرحلهی GV متوقف سازد. در پایان نتایج نشان داد که هم ROS و هم IBMX قادرند بلوغ میوزی را در اووسیتهای گوسفند مهار کنند و این مهار احتمالا میتواند به بلوغ سیتوپلاسمی برای بالا بردن شایستگی اووسیت کمک کند.
کلمات کلیدی: بلوغ میوزی- -IBMX -ROS اووسیت گوسفند.
مقدمه
در گونههای حیوانی فنآوریهای مرتبط با تولیدمثل همانند باروری برونتنی، تولید رویان و شبیهسازی به خاطر کمبود اووسیت-های شایسته موفقیتهای کمی را در پی دارد. این عدم شایستگی اووسیت بیشتر به این دلیل است که در شرایط برونتنی، بلوغ میوزی به طور خودبخودی پیش میرود و این در حالی است که بلوغ سیتوپلاسمی که برای مراحل بالاتر تولید رویان لازم است به کندی پیش میرود. بنابراین اگر بتوان بلوغ میوزی را مهار کرد، میتوان یک هماهنگی بین آن و بلوغ سیتوپلاسمی ایجاد کرد و اووسیتی با شایستگی بالا تولید کرد. برای مهار بلوغ میوزی در اووسیت پستانداران از مواد و روشهای گوناگونی استفاده شده است. بعنوان مثال، در بعضی از مطالعات با استفاده از مهارکنندههای فسفو دی استراز و با بالا بردن سطح آدنوزین مونو فسفات حلقوی - cAMP - در اووسیت توانستهاند بلوغ میوزی را متوقف کنند و یا آن را به تاخیر بیاندازند . - 3-1 - در دیگر مطالعات از ترکیباتی که میتوانند به طور موقت باعث مهار فعالیت فاکتور پیش برندهی بلوغ - MPF - شوند، استفاده شده است . - 5-4 - دو تا از این ترکیبات -3 ایزوبوتیل -1 متیل گزانتیل - IBMX - و روسکوویتین - ROS - میباشند که به طور موفقیت آمیزی در مطالعات بر روی موش - - 6، اسب - 7 - ، گاو - - 8، خوک - 5 - ، بز - - 4 و موش صحرایی استفاده شده است اما به نظر میرسد مطالعهای که اثرات این دو ترکیب را بر ادامهی بلوغ میوزی اووسیت گوسفند بررسی کرده باشد موجود نیست. بنابراین هدف از مطالعه حاضر بررسی دو غلظت مختلف از این دو مهار کننده بر ادامهی بلوغ میوزی اووسیت گوسفند بود.
مواد و روشها
تخمدانهای گوسفندی از یک کشتارگاه محلی جمعآوری و به آزمایشگاه منتقل شدند. فولیکولهای با قطر 2-5 میلیمتر با استفاده از سوزن شماره 20 که به یک پمپ خلا متصل شده بود آسپیره شدند. در این آزمایشها اووسیتهای با سیتوپلاسم یکنواخت و روشن و واجد حداقل 4 لایه سلولهای کومولوس متراکم استفاده شدند. کمپلکسهای کومولوس- اووسیت انتخاب شده 3 بار با محیط شستشو و 2 بار با محیط کشت بلوغ شسته میشدند و سپس برای بلوغ به پتریدیشهای پلاستیکی دارای قطرههای 50ʽl محیط کشت که زیر روغن معدنی بودند منتقل میشدند و به مدت 26 ساعت در انکوباتور نگهداری میشدند. محیط کشت بلوغ مورد استفاده TCM-199 بود که با FBS %10، 0.5 ʽg/ml FSH، 5 ʽg/ml LH و پنیسیلین و استرپتومایسین مکمل شده بود. غلظتهای مختلف 12/5 - و 25 میکرومولار - روسکوویتین و 0/5 - IBMX و1 میلیمولار - برای ارزیابی عملکردش بر ادامه-ی میوز اووسیتهای گوسفند به محیط کشت بلوغ اضافه شدند.
نتایج تاثیر غلظتهای مختلف IBMX و ROS بر روند ادامهی میوز با استفاده از آزمون کای اسکوار ارزیابی شد و بدین منظور از نرم افزار SAS نسخهی 9/12 و رویهی GENMOD استفاده گردید.
نتایج و بحث
همانطور که در جدول 1 مشاهده میشود، بعد از 26 ساعت کشت، IBMX در هر دو غلظت بلوغ میوزی را متوقف میکند و نسبت به گروه کنترل، بطور معنیداری از خروج اولین جسم قطبی که لازمه متافاز دو است جلوگیری میکند . - p < 0.05 - این نتایج با مطالعات دیگر در موش - 6 - و گاو - - 1 مطابقت دارد.
علاوه بر IBMX، غلظتهای مختلف ROS نیز توانسته بود از خروج اولین جسم قطبی، بعنوان بلوغ میوزی کامل، جلوگیری کند و درصد کمتری از اووسیتها را به مرحله متافاز دو برساند. همانطور که در جدول ملاحظه میشود، روسکوویتین همچنین توانسته بود درصد بالاتری از اووسیتها را در مرحلهی GV نگه دارد. این نتایج در مطالعات روی اووسیتهای بز - 4 - ،گاو - - 8 و اسب - 7 - نیز گزارش شده بود.
روسکوویتین و IBMX هر دو ترکیباتی توانمند برای مهار بلوغ در اووسیت پستانداران هستند اما مکانیسم عمل آنها متفاوت است.
ترکیب IBMX قادر است با مهار آنزیم فسفودی استراز باعث افزایش غلظت cAMP در اووسیت شود. نشان داده شده است که افزایش غلظت cAMP باعث تغییراتی در فعالیت پروتئین کیناز A میشود که این کیناز نقش کلیدی در کنترل میوز تعدادی از پستانداران بویژه موش و موش صحرایی بازی میکند . - 9 - همانطور که در جدول مشاهده میشود، IBMX در پایان دوره کشت در هیچ یک از دو غلظت تاثیر معنیداری بر GV نداشت. این نتایج نیز با نتایج بدست آمده در گاو یکسان بود بطوریکه سیرارد و همکاران - 1988 - - که در آزمایش خود از آنالوگ cAMP استفاده کرده بودند - و همچنین بارتو و همکاران - - 2007 نشان دادند که افزایش cAMP در اووسیت باعث تاخیر در ادامهی بلوغ در ساعات اولیه کشت میشود اما در پایان 24 ساعت بین تیمارها هیچ تفاوتی به لحاظ اووسیتهای مرحلهی GV وجود نداشت.
روسکوویتین یک مشتق پورینی است که توانایی زیادی در بازدارندگی سایکلین وابسته به کیناز - - CDK دارد. این مهارکننده در سطوح میکرومولار بوسیله مهار ساخت DNA، مانع پیشرفت چرخه سلولی پستانداران در نقطه G1-S و G2-M و همچنین فعالیت MAPK میشود.
بخوبی مشخص شده است که آبشار پیچیدهای از وقایع فسفریلاسیون و دِفسفریلاسیونی در تنظیم ادامهی میوز درگیر میشود و پروتئینی به نام فاکتور پیشبرندهی بلوغ - MPF - که فعالسازی آن با شکسته شدن غشای وزیکول - - GVBD همراه است، مسئول آغاز بلوغ اووسیت میباشد. فاکتور پیشبرنده بلوغ، کمپلکسی متشکل از سیکلین B - زیر واحد تنظیمی - و کیناز p34Cdc2 - زیر واحد کاتالیک - میباشد. فرم فعال MPF قادر است تا پروتئینهایی که پیشرفت میوزی را تشکیل میدهند را فسفریله کند و آنها را در متراکم سازی کروموزوم و بازسازی اسکلت سلولی درگیر کند . - 10 - علاوه بر MPF، کیناز دیگری به نام MAPK نیز در تنظیم بلوغ میوزی اووسیت درگیر میشود . - 11 - به نظر میرسد تاثیر مهاری روسکوویتین بر ادامهی بلوغ میوزی اووسیتهای گوسفند، از طریق مهار فعالیت این دو فاکتور باشد زیرا گزارش شده است که روسکوویتین قادر است این دو را مهار کند.
این نتایج نشان میداد که هر دوی IBMX و ROS قادرند بلوغ میوزی را در اووسیتهای گوسفند مهار کنند، اما روسکوویتین ترکیب توانمندتری برای مهار اووسیت در اولین مراحل تقسیم میوزی میباشد. با مهار بلوغ اووسیت در یک دوره کشت و کشت مجدد آن بدون مهار کننده میتوان اووسیتی با شایستگی بالاتر برای مراحل بالاتر تکوین رویانی ایجاد کرد.
