بخشی از مقاله
چکیده
هدف از این تحقیق بررسی تاثیر دوزهاي مختلف رتینوئیک اسید آل ترانس بر بلوغ آزمایشگاهی تخمکهاي کومولوسدار نابالغ گوسفند بود. تخمکهاي کومولوسدار از فولیکولهائی با قطر 2-6 میلیمتر به روش آسپیرهکردن در شرایط استاندارد گرفته شدند. رتینوئیک اسید ال ترانس در دوزهاي 0 ،1، 1/5 و 2 میکرومولار به محیط کشت بلوغ اضافه شدند. براي انجام فرایند بلوغ همه تیمارها به مدت 24 ساعت داخل انکوباتور قرار داده شدند
فرایند آغاز میوز و بلوغ تخمک پس از رنگآمیزي با میکروسکوپ اینورت بررسی شده و نتایج حاصل با رویه GLM تجزیه و تحلیل شدند. بلوغ تخمک در غلظت 2 میکرومولار نسبت به تیمار کنترل و تیمار یک میکرومولار افزایش معنیداري را نشان داد
نتایج حاصل از این بررسی نشان داد افزودن دو میکرومولار رتینوئیک اسید به محیط کشت بلوغ حاوي تخمک هاي نابالغ، بلوغ تخمک ها را در محیط کشت تجاري TCM199 بهبود می بخشد.
مقدمه
تقسیمات اووسیت پستانداران در دوران جنینی در مرحله دیپلوتن از پروفاز میوز یک متوقف می شوند. روند تقسیم با قرارگرفتن تخمکها در محیط کشت مجدداً فعال می شود. این فرایند که به وسیله جمع شدگی تدریجی کروماتین و ناپدید شدن هسته متراکم و غشاي هسته اي توصیف شده است، مرحله شکستن حباب زاینده - - Germinal Vesicle نام دارد .
بلوغ تخمک نابالغ شامل بلوغ هسته اي و بلوغ سیتوپلاسمی است. مهاجرت گرانولهاي قشري - Cortical - Granules مرحله ي مهمی در بلوغ سیتوپلاسمی به شمار می رود. در هنگام بلوغ، اکثر گرانولهاي قشري از جایگاه تولید به سمت غشاي پلاسمایی حرکت می کنند. لقاح موفق وابسته به این تغییرات است و اکثر تخمکها بلوغ سیتوپلاسمی و هسته اي خود را پس از لقاح تکمیل می کنند
رتینوئیدها خانواده بزرگی از ترکیبات طبیعی - All-trans - Retinol هستند که نقش مهمی در رشدونمو مهرهداران و تمایز سلولی دارند . - 4 - رتینوئیک اسید با تشکیل و یا تغییر الگوي فعالیت هومیوباکس روي سلول میتواند بلوغ سیتوپلاسمی و ظرفیت تخمک را براي بهبود رشدونمو تحت تاثیر قرار دهد - . - 7 از طرفی رتینوئیدها بدلیل اثرات آنتی اکسیدانی خود بعنوان فاکتور رشد جهت بلوغ تخمک و رشد اولیه رویان در آزمایشگاه مورد استفاده قرار می گیرند.
مواد و روش ها
نمونههاي تخمدان از کشتارگاه کرج راك واقع در حوالی کرج جمعآوري شدند. تخمدانها بلافاصله پس از کشتار درون ترموفلاسک حاوي سالین گرم 30-35 - درجه سانتی گراد - و یک درصد پنی سیلین– استرپتومایسین جمع آوري شده و در مدت کمتر از یک ساعت به آزمایشگاه فیزیولوژي گروه علوم دامی دانشگاه تهران انتقال مییافت. جمعآوري تخمک-ها به روش آسپیرهکردن از فولیکولهاي آنترال به قطر 2-6 میلیمتر صورت گرفت.
پس از ارزیابی تخمکهاي کومولوس-دار به کمک پیپت پاستور 4 بار توسط محیط کشت HEPES-TCM-199 که با 5 درصد سرم جنین گاوي و یک درصد پنیسیلین– استرپتومایسین غنی شده بود و یک بار نیز با محیط بلوغ TCM-199 که حاوي ده درصد سرم جنین گاوي، 100 IU/ml پنیسیلین، 100 μg /ml استرپتومایسین، LH 0/01 IU/ml و FSH 5 μg/ml بود، شستشو داده میشدند.
تخمکهاي کومولوسدار مناسب مطابق گروه هاي زیر انتخاب شدند.
گروه کنترل 149 - تخمک نابالغ گوسفند - ، تیمار اول 141 - تخمک نابالغ - ، تیمار دوم 153 - تخمک نابالغ - و تیمار سوم 157 - تخمک نابالغ - و در سه تکرار در محیط کشت TCM-199 حاوي ده درصد سرم جنین گاوي، 100 IU/ml پنی-
سیلین، 100μg /ml استرپتومایسین، LH 0/01 IU/ml و FSH 5 μg/ml کشت داده شدند. محیط کشت تیمارهاي کنترل، اول، دوم وسوم به ترتیب داراي غلظت هاي متفاوتی از رتینوئیک اسید ال ترانس - صفر، 1، 1/5 و 2 میکرومولار - بودند
پتري دیشهاي حاوي تخمک نابالغ به مدت 24 ساعت در داخل انکوباتور با دماي 38/5 درجه سانتی گراد، 5 درصد CO2 و 95 درصد رطوبت قرار داده شدند. پس از 24 ساعت ، ابتدا پراکندگی کومولوسی ارزیابی شد و سپس تخمکها به وسیله ي 100 IU/ml آنزیم هیالورونیداز بدون کومولوس شدند . سپس وضعیت هسته تخمکها با استفاده از اورسئین یک درصد ارزیابی گردید. تخمکهاي بدون تغییر شکل در هسته - نابالغ - به عنوان GV، تخمکهاي با هسته ي شکسته به عنوان - Germinal Vesicle Break Down - GVBD با نشانه شروع تقسیم میوز و تخمکهاي بالغ متافاز دو شناسایی شدند.
با توجه به ماهیت داده ها که بصورت تعداد و درصد بودند، بنابر این توام با انجام تجزیه و تحلیل دادهها با استفاده از رویه GLM نرم افزار SAS - SAS، - 2003 توزیع نرمال با قیماندهها نیز با آزمون شاپیرو- ویک مورد بررسی قرار گرفت. در صورت نیاز از تبدیلهاي جذري و آرك سینوس استفاده شد. مدل آماري - با طرح پایه طرح کاملا تصادفی - مورد استفاده براي تجزیه وتحلیل داده ها بصورت زیر بود، که در این مدل yij برابر با میزان مشاهده بدست آمده، μ میانگین کل جمعیت، ti اثر تیمار iام وeij برابر میزان باقیمانده می باشد.
نتایج
در این تحقیق 600 تخمک نابالغ پس از ارزیابی پراکندگی کومولوسی، رنگ آمیزي شده و وضعیت هسته اي آن ها مورد بررسی قرار گرفت . هیچ یک از تخمکها در مرحله ي GV مشاهده نشدند. تعداد تخمکها در مرحله GVBD در تیمار کنترل نسبت به تیمار یک میکرومولار و دو میکرومولار تفاوت معنیداري را نشان داد . - P<0/05 - در بین سایر تیمارها تفاوت معنیداري مشاهده نشد. در مرحله متافاز یک بین تیمارها تفاوت معنیداري براي تعداد تخمکها مشاهده نشد.
تعداد تخمکها در مرحله متافاز دو تفاوت معنی داري بین تیمار2 میکرومولار و تیمارهاي کنترل و یک میکرومولار نشان داد . - P<0/05 - در این مرحله تفاوت معنیداري بین تیمار 1/5 و 2 میکرومولار مشاهده نشد - جدول . - 1
بحث سلولهاي کومولوس- گرانولوزا نقش مهمی در بلوغ تخمک دارند. این سلولها قبل از تخمک ریزي از بلوغ تخمک حمایت کرده و در هنگام تخمکریزي، انتقال تخمک به لوله تخم بر را آسان می کند. برخی از گیرندههاي رتینوئیک اسید بر سلولهاي کومولوس قرار دارند.
بنابراین رتینوئیک اسید آل ترانس قادر به تنظیم رونویسی در سلولهاي کومولوس گرانولوزا هستند واز این طریق سبب بهبود در رشد و نمو رویان میشود . - 5 - میدیکین فاکتور رشد موجود در مایع فولیکولی گاو است که افزودن آن به محیط کشت سبب افزایش تولید بلاستوسیت میشود.
رتینوئیک اسید آل ترانس می-تواند m-RNA میدیکین را در سلولهاي گرانولوزاي کشت شده افزایش دهد. میدیکین از آپوپتوزیس سلولهاي کومولوس در محیط کشت جلوگیري می کند، بنابراین رتینوئیک اسید میتواند بلوغ سیتوپلاسمی اووسیت را از طریق تولید میدیکین در سلولهاي کومولوس افزایش دهد . - 2 - استفاده از رتینوئیک اسید هنگام بلوغ آزمایشگاهی منجر بهتاثیرات وابسته به دوز می باشد.
بطوریکه با افزایش دوز رتینوئیک اسید درغلظت 10-15 میکرومولار، تعداد تخمکهایی که به مرحله بلوغ رسیدند، نسبت به گروه کنترل کاهش پیدا کردند . - P<0/05 - در حالیکه با کاهش میزان دوز رتینوئیک اسید، میزان بلوغ افزایش یافت . در ادامه این کاهش، استفاده از دوز 0/25 و 0/5 میکرومولار رتینوئیک اسید درصد بلوغ را در مقایسه با 2 میکرومولار به میزان کمتري افزایش داد.
لذا به نظر می رسد این ویتامین داراي یک نقطه اثر اپتیمم است که میزان بلوغ در دوطرف آن کاهش می یابد. در این میان دوز 2 میکرومولار اپتیمم مقدار میباشد . - 9 - رتینوئیک اسید به دلیل نقش آنتی اکسیدانی قادر است سلول را در مقابل مرگ سلولی، آپوپتوزیس القا شده با تنش اکسیداتیو حفظ کند که این تاثیرات به وسیله مسیرهاي مستقل و وابسته به گیرنده هاي هسته اي میانجیگري شدهاند
نتایج این پژوهش نشان داد که غلظت هاي صفر، 1، 1/5 و 2 میکرو مولار رتینوئیک اسید میزان پراکندگی سلول هاي کومولوس را پس از 24 ساعت کشت تحت تاثیر قرار نمیدهد. در این مطالعه به نظر می رسد برخی از خصوصیات مفید رتینوئیک اسید بلوغ تخمک را بهبود بخشیده است. در نهایت این تحقیق نشان داد که افزودن دو میکرومولار به طور معنی داري بلوغ تخمک را بهبود می بخشد.
