بخشی از مقاله
چکیده
فنیل آلانین دهیدروژیناز واکنش برگشت پذیر دآمیناسیون اکسیداتیو -L فنیل آلانین به فنیل پیروات را در حضورNAD+ کاتالیز می نماید. این آنزیم به منظور استفاده در کیت هاي تشخیص طبی فنیل کتونوري و همچنین سنتز ترکیبات دارویی مورد توجه زیادي قرار گرفته است. هدف از این تحقیق، دستیابی به روش مناسب و اقتصادي در تخلیص فنیل آلانین دهیدروژیناز نوترکیب بود. روشها: استخراج و تخلیص فنیل آلانین دهیدروژیناز نوترکیب در سامانه هاي دو فازي آبی پلی اتیلن گلیکول و آمونیوم سولفات مطالعه گردید.
در فرایند دیگر، آنزیم بوسیله تیمار گرمایی، رسوب دهی با سولفات آمونیوم 30 و60 درصد و روشهاي کروماتوگرافی تخلیص شد. پیشرفت روند تخلیص در این مسیرها با استفاده از الکتروفورز تعیین گردید. نتایج: فنیل آلانین دهیدروژیناز نوترکیب در سامانه هاي دو فازي آبی تشکیل شده از پلی اتیلن گلیکول 8/5 درصد 6000 دالتون و آمونیوم سولفات 17/5 درصد، در یک مرحله ي جداسازي تخلیص شد. بازده، فاکتور تخلیص و فعالیت ویژه به ترتیب 94/42 درصد، 491/93 و 9828/88 U/mg بدست آمدند.
تحت مطلوب ترین شرایط در تکنیک هاي کروماتوگرافی، فعالیت ویژه، بازده و فاکتور تخلیص به ترتیب 553/57 U/mg ، 25/12 درصد و 40/52 محاسبه گردید. نتیجه گیري: در مجموع، مطالعه روش هاي تخلیص نشان داد که سامانه هاي دو فازي آبی می توانند به عنوان یک فناوري قدرتمند، اقتصادي و موثر در تخلیص و بازیافت فنیل آلانین دهیدروژیناز مورد استفاده قرار گیرند.
واژه هاي کلیدي: سامانه هاي دو فازي آبی، کروماتوگرافی، مقایسه، تخلیص، فنیل آلانین دهیدروژیناز.
مقدمه
فنیل آلانین دهیدروژیناز یکی از آنزیمهاي مهم و شناخته شدة خانوادة آمینو اسید دهیدروژینازها محسوب می شود. این آنزیم نقش مهمی در کاتابولیسم -L فنیل آلانین در باکتریها ایفاء کرده و واکنش برگشت پذیر دآمیناسیون اکسیداتیو -L فنیل آلانین به فنیل پیروات را کاتالیز می نماید. کاربردهاي مهم این آنزیم شناسایی وغربال گري بیماران میتلا به فنیل کتونوري و نیز سنتز خالص اسید آمینه فنیل آلانین و آنالوگهاي آن جهت استفاده در صنایع دارویی و غذایی می باشد.
یکی از مسائل مهم در کاربرد این بیوکاتالیزور مهم، روش تخلیص مناسب و بهینه سازي آن است. در این مطالعه به منظور دستیابی به بهترین روش، تکنیکهاي کروماتوگرافی و سامانه هاي دوفازي آبی مورد مقایسه قرار می گیرند.
موادها و روشها
تخلیص فنیل آلانین دهیدروژیناز نوترکیب سامانه هاي دو فازي آبی: هر سامانه دو فازي آبی با حل کردن مقادیر متناسب از پلی اتیلن گلیکول و آمونیوم سولفات در آب دوبار تقطیر تهیه شد. سپس محلول آنزیمی به آن اضافه شده و به مدت 60 دقیقه و دور 3500rpm سانتریفوژ شدند. حجم هاي دو فاز بالا و پایین اندازه گیري شده وجهت سنجش فعالیت آنزیم و تعیین غلظت پروتئین از هم جدا گردیدند .
کروماتوگرافی عصاره سلولی بدست آمده از سونیکاسیون، سانتریفوژ شده و به مدت 15 دقیقه در انکباتور 50°C قرار داده شد. سپس آن را همانند مرحله قبل سانتریفوژ کرده و با آمونیوم سولفات 30-60 درصد اشباع رسوب گذاري گردید. نمونه آنزیمی پس از انجام دیالیز در ستون در سیستم کروماتوگرافی بکار برده شد. جدا سازي پروتئین هاي متصل شده به رزین ، با استفاده از شیب بافر پتاسیم فسفات pH =7/0 و کلروسدیم 0/1 مولار انجام شد. لوله هاي حاوي فعالیت آنزیمی جمع آوري شده و پس از تغلیظ، در ستون ژل فیلتراسیون متصل به سیستم کرماتوگرافی مایع با کارایی بالا وارد گردیدند. در نهایت خلوص آنزیم بوسیله الکتروفورز آنالیز شد.
سنجش فعالیت آنزیمی: فعالیت آنزیم فنیل آلانین دهیدروژیناز در طول موج 340nm ارزیابی شد. مخلوط واکنش شامل محلولهاي ازNAD+، فنیل آلانین، بافر ومحلول آنزیمی در حجم کلی 1 میلی لیتر بود . سنجش محتوي پروتئین: تعیین غلظت پروتئین در تمام آزمایشات تخلیص با استفاده از کیت سنجش پروتئین انجام شد. آنالیز روند تخلیص در سامانه هاي دو فازي آبی و روشهاي کروماتوگرافی با استفاده از الکتروفورز انجام شد.
نتایج و بحث در این مطالعه از آنزیم فنیل آلانین دهیدروژیناز نوترکیب به عنوان مدلی جهت ارزیابی روشهاي مختلف تخلیص نظیر سامانه هاي دو فازي آبی، روشهاي رسوبی و تکنیکهاي کروماتوگرافی استفاده شد. تفکیک و تخلیص فنیل آلانین دهیدروژیناز نوترکیب در سامانه هاي دو فازي تشکیل شده از پلی اتیلن گلیکول و آمونیوم سولفات مطالعه شد. در بین سامانه هاي مختلف بررسی شده، بهترین پارامترهاي تخلیص در سامانه دو فازي تشکیل شده از پلی اتیلن گلیکول 6000 دالتون %8/5 و آمونیوم سولفات %17/5 بدست آمدند.
فرآیند تخلیص دیگر شامل تیمار گرمایی، رسوب گذاري با سولفات آمونیوم 30 و 60 درصد، کروماتوگرافی تعویض آنیونی بر روي ستون و کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون بر روي ستون بود. فعالیت ویژه، بازده و فاکتور تخلیص به ترتیب 290/1 U/mg ، 51/81 درصد و 21/23 بدست آمدند. مقایسه هزینه هاي مصرف شده و پارامترهاي بدست آمده از تخلیص فنیل آلانین دهیدروژیناز در روشهاي مختلف نشان داد که بهترین و کارآمدترین روش، استفاده از سامانه هاي دو فازي آبی است در حقیقت نتایج بدست آمده اثبات نمودند که این سامانه ها می توانند به عنوان روش هاي ساده، سریع، ارزان و اقتصادي در تخلیص آنزیم مذکور در مقیاس صنعتی مورد استفاده قرار گیرند.
