بخشی از مقاله
چکیده
تنوع ژنتیکی در گونههای گیاهی برای انتخاب نژادهای والدینی در جهت حصول هیبریدهای مناسب در محصولاتی که هیبرید آنها ارزش تجاری دارند، مهم است. جهت بررسی تنوع ژنتیکی گیاهی روشهای متفاوتی وجود دارد از جمله روشهای کلاسیک، استفاده از صفات مورفولوژیک میباشد اما به دلیل اینکه تعداد صفات مورفولوژیک محدود بوده و تحت تأثیر سن گیاه و محیط قرار دارند، امروزه از روشهای مطمئنتری مانند نشانگرهای مولکولی استفاده میشود. لی و کویروس در سال 2001 برای اولین بار نشانگر مولکولی جدیدی به نام SRAP را معرفی کردند . SRAP یک سیستم مارکر مبتنی بر PCR با دو آغازگر است، آغازگر رو به جلو با 17 پایه و یک آغازگر معکوس با 18 پایه است و با استفاده از آغازگرهای ترکیبی، اندازهی DNA را در مناطق ORF مشخص میکند.این مطالعه، تنوع ژنتیکی برروی جمعیتهای شنبلیله ایرانی با استفاده از پنج ترکیب مارکر مولکولی SRAP صورت گرفت.
گروهبندی به روش UPGMA و ضریب تشابه جاکارد انجام شد و جمعیتها در چهار گروه قرار گرفتند، که جمعیتهای منطقه جغرافیایی مشابه در گروه مجزا قرار گرفتند. همچنین آمارههای تنوع ژنتیکی محاسبه شد و نتایج حاصل نشان داد که درصد چند شکلی آغازگرهای SRAP به طور میانگین 64.8 درصد بود که نشاندهنده وجود تنوع بالا در بین جمعیتها و قابلیت نشانگری SRAP در آن میباشد.
مقدمه
آگاهی از تنوع ژنتیکی و مدیریت منابع ژنتیکی، ضمن حفاظت ذخایر ژنتیکی، قابلیت استفاده از آنها را در برنامه اصلاحی ممکن میسازد.[6] همچنین از تنوع ژنتیکی در گونههای گیاهی برای انتخاب نژادهای والدینی در جهت حصول هیبریدهای مناسب و پیش بینی بنیه هیبرید به ویژه در محصولاتی که هیبرید آنها ارزش تجاری دارند، مهم است.[7] گذشته از این میتوان لاین ها و ارقام محلی دارای صفات مطلوب را گزینش و خزانه ژنتیکی را جهت استفاده در پروژه های به نژادی غنی نمود.[1] جهت بررسی تنوع و ساختار ژنتیکی ژنوتیپهای گیاهی روشهای متفاوتی وجود دارد از جمله روشهای کلاسیک، استفاده از صفات مورفولوژیک میباشد؛ اما با توجه به اینکه تعداد صفات مورفولوژیک محدود بوده و تحت تأثیر سن گیاه و محیط قرار دارند،
امروزه از روشهای مطمئنتری مانند نشانگرهای مولکولی استفاده میشود. نشانگرهای مبتنی بر واکنشهای زنجیرهای پلیمراز به دلیل سادگی و نیاز به مقادیرDNA کم، کاربرد زیادی دارند. انتخاب نوع نشانگرهای مولکولی به تکرارپذیری بالا، سادگی روش و هزینه پایین و قابلیت اعتماد بالای آن بستگی دارد8] و.[2 لی و کویروس در سال 2001 برای اولین بار نشانگر مولکولی جدیدی به نام SRAP را معرفی کردند این سیستم در ابتدا بر روی گونه های براسیکا - brassica - توسعه یافت سپس در سایر محصولات مانند سیبزمینی، برنج، سیب، مرکبات، الو، سیر، کاهو و کرفس انجام شد. SRAP یک سیستم مارکر مبتنی بر PCR با دو آغازگر است، آغازگر رو به جلو با 17 پایه و یک آغازگر معکوس با 18 پایه است و با استفاده از آغازگرهای ترکیبی، اندازهی DNA را در مناطق ORF مشخص میکند.[9]
شنبلیله گیاهی یکساله و از خانواده Papilionaceae میباشد، منشأ این گیاه نواحی آفریقای شمالی و سواحل شرقی مدیترانه است، طبق نظر بعضی کارشناسان و محققین این گیاه در آغاز بومی ایران بوده و سپس به دیگر مناطق منتقل شده است.و به مقدار فراوانی در نقاط مختلف نیاد مخصوصاً آسیا، آفریقا و نقاط مختلف ایران کشت میشود. سالیان درازی دانههای این گیاه علاوه بر استفادههای خوراکی ، به عنوان داروی گیاهی نیز مورد مصرف قرار میگرفته است3] و.[4 با این حال شنبلیله به عنوان گیاه دارویی و غذایی ارزشمند است. صادق زاده اهری و همکاران[5] در بررسی تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگرAFLP بر روی 20 توده بومی شنبلیله ایران، ضمن اثبات کارایی این نشانگر، استفاده از آن را در مطالعات تنوع ژنتیکی بر روی شنبلیله توصیه نمودند. مطالعات بسیاری در دنیا با استفاده از نشانگرهای مولکولی [12-10]RAPED، [10, 13]SSR، [14] AFLPو [11]ISSR در بررسی تنوع ژنتیکی بر روی شنبلیله انجام شده، همچنین مطالعات دیگری با استفاده از نشانگر مولکولی SRAP بر روی گیاهانی مانند پنبه[15]، گندم[16] ، گوجه فرنگی[17]، تربچه[18] و... انجام گرفته اما تاکنون مطالعه گستردهای در بررسی تنوع ژنتیکی بر روی شنبلیله با استفاده از نشانگر مولکولی SRAP انجام نشده است.
مواد و روش ها
در این بررسی بذر20 توده، شنبلیله بومی مناطق مختلف ایران - جدول 1که - به طور سنتّی و از دیرباز در آن مناطق کشت میشدند، جمعآوری و در مزرعه تحقیقات کشاورزی دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوریهای پیشرفته کرمان در قالب طرح بلوکهای کاملا تصادفی کشت شدند. در طول فصل رشد به صورت منظم و هفتهایی دو بار آبیاری انجام شد و علف های هرز به صورت مکانیکی در چندین مرحله بر حسب نیاز حذف شدند.
ابتدا از هر جمعیت 7 نمونه تک بوته، به میزان 70 تا 100 میلیگرم برگ تازه در داخل تیوبهای 1/5 میلیلیتری اپندورف کدگذاری شده با نام ارقام نمونهگیری شد و بلافاصله نمونهها در حضور ازت مایع فریز شدند و تا زمان استخراج در یخچال منفی 80 درجه سانتی گراد نگهداری شدند، سپس استخراج به روش [19] CTAB با اندکی تغییر انجام شد.
واکنش زنجیره ای پلیمراز - PCR -
تعداد 5 ترکیب آغازگر SRAP برای بررسی تنوع ژنتیکی جمعیتها مورد استفاده قرار گرفت. هر مخلوط واکنش با حجم نهایی12.5 میکرولیتر شامل2 میکرولیتر DNA الگو 25 - نانوگرم در میکرولیتر - ، 0.5 میکرولیتر از هر یک آغازگرهای SRAP، 3.25 میکرولیتر آبمقطر استریل و 6.25 میکرولیتر کیت PCR - cinnaGen, ltd, taq Dna polymeraze master mix -1.5 mM Mgcl2, 0 .4mM dntpS, pcr buffer - بود. تکثیر در دستگاه ترموسایکلر با چرخه های PCR دو مرحله ایی شامل یک چرخه واسرشتسازی اولیه در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 4 دقیقه، سپس 5 چرخه شامل واسرشتسازی در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، مرحله اتصال آغازگر در دمای 42 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه و مرحله گسترش در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 2 دقیقه، سپس 34 چرخه شامل واسرشتسازی در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، مرحله اتصال آغازگر در دمای 54 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه و مرحله گسترش در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 2 دقیقه و یک چرخه گسترش نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه انجام شد.
2الکتروفورز
پس از تکثیر، . جهت مشاهده چندشکلی بین نمونهها، محصول PCR بر رو ژل آگاروز 1.5 درصد در بافرTBE الکتروفورز گردید. از هر نمونه به میزان 10 میکرولیتر برداشه و در چاهکها بارگیری شدند، الکتروفورز با ولتاژ 60 ولت و به مدت 3 ساعت اجرا گردید. برای تعیین اندازه قطعات از نشانگر با باند های استاندارد 1 kbp استفاده شد. سپس ژل به مدت 10 الی 15 دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید رنگآمیزی شد، و بعد از شستشو با آبمقطر عکسبرداری از ژل به وسیله دستگاه ژل داک زیر نور UV صورت گرفت.
تجزیه تحلیل داده ها
ابتدا الگوهای آللی به صورت یک - وجود - و صفر - عدم وجود - امتیازدهی شدند، و برای تشکیل ماترس دادههای خام، ستونها به داده یا ارقام و سطرها به باندها اختصاص یافت و اعداد وارد نرافزار Exel شدند.
