بخشی از مقاله
چکیده:
به منظور بررسی تنوع ژنتیکی جمعیتهاي وحشی ایرانی یونجه - Medicago sativa .L - و بررسی ارتباط عوامل اکولوژیکی وپروتئینهاي کل،21 جمعیت بذري یونجه موجود در بانک ژن منابع طبیعی انتخاب شدند. در این تحقیق الگوي پروتئینی 210 ژنوتیپ از 21 جمعیت بذري براي تعیین میزان تنوع ژنتیکی موجود مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج SDS-PAGE، 44 باند قابل تکثیر، پپتید پروتئینی، براي مطالعه تنوع ژنتیکی ثبت گردید. میانگین تعداد باندهاي پلیمورف نسبت به کل باندها در کلیه جمعیتهاي بذري از 0/030 تا 0/172 متغیر و به ترتیب مربوط به کرج1 و اهر بود. SDS-PAGE پروتئینهاي کل، تنوع درون و میان جمعیتی بالایی نشان دادند که تمایز مشخصی بر اساس منشاء و رویشگاه نشان ندادند.
همبستگی بین ماتریس فاصلههاي ژنتیکی و جغرافیایی به وسیله آزمون مانتل ثابت نشد و ضریب همبستگی بین آنها از نظر آماري معنی دار نگردید P=0/10 - و . - R=0/0281 این مسئله نیز نشان دهنده عدم وجود شیب محیطی در گوناگونی پروتئینهاي کل است. از آنجایی که ایران مرکز تنوع گونه یونجه است، چنین تنوع بالایی در ویژگیهاي مختلف این گیاه دور از انتظار نمیباشد. بنابراین در برنامههاي اصلاحی یونجه میبایست تنوع ژنتیکی ارقام یونجه بوسیله استفاده از والدین مختلف افزایش یابد. افزایش اساس ژنتیکی براي اصلاح یونجه میتواند بوسیله کاربرد سیستماتیکی ژرمپلاسم که الگو پروتئینی متفاوتی داشته و ویژگیهاي کمی بهتري دارند حاصل شود.
واژگان کلیدي: تنوع ژنتیکی، پروتئینهاي کل، عوامل اکولوژیکی، Medicago sativa
مقدمه:
یونجه - Medicago sativa .L - از جمله گیاهان علوفهاي بومی ایران است که در شرایط متنوع آب و هوایی می روید. یونجه در هر منطقه از ایران با نام و رقم معینی کشت و کار میگردد. این گیاه با ارزش قادر است با گسترش ریشههاي خود به خوبی در برابر خشکی مقاومت نماید و در خاكهاي فقیر، از نیتروژن هوا استفاده کند. یونجه در برابر سرما و گرما مقاوم بوده و با شرایط گوناگون سازگاري دارد. درصد پروتئین زیاد و همچنین برخورداري از مواد معدنی قابل توجه از قبیل کلسیم، فسفر، منیزیم و دارا بودن انواع ویتامینها به خصوص ویتامین A، علوفه یونجه را به عنوان یکی از مناسبترین اجزاء تشکیل دهنده در جیره غذایی دام نموده به طوري که منجر به افزایش قابل توجهی در تولیدات دامی میگردد . - Vankeuren, 1972 -
تلاشهاي بسیاري براي بهنژادي یونجه با هدف بدست آوردن رقمی که عملکرد علوفه سبز و علوفه خشک آن بالا و همچنین میزان زیادتري پروتئین داشته باشد صورت گرفته است . - Koochaki et al., 1985 - اصلاح نباتات بر پایه تنوع و گزینش بنا نهاده شده است.. اگرچهاخیراًنشانگرهاي مولکولی متعددي براي برآورد تنوع ژنتیکی وجود دارد ولی الکتروفورز پروتئینها همواره روشی مناسب و مرسوم براي برآورد تنوع ژنتیکی در گیاهان به شمار رفته است، زیرا علاوه بر هزینه پایین، ارتباط آنها با بخش فعال ماده ژنتیکی - ژنهاي ساختاري - بیشتر از اغلب نشانگرهاي مرتبط با DNA بوده و کارایی بالاتري دارد . - Manoosi et al., 2010 -
پژوهشگران میتوانند بوسیله اطلاعات حاصل ازمارکر پروتئینی ژنوتیپهاي برتر را انتخاب کنند تا از آنها به عنوان والدین براي هیبریداسیون و معرفی جمعیتهاي جدید استفاده شود . - Ghafoor and Arshad, 2008 - پژوهشها بر روي یونجه با استفاده از مارکر پروتئینی - SDS-PAGE - حاکی از کارایی بالاي این مارکر در بررسی تنوع ژنتیکی درون و میان جمعیتی است Farshadfar et al., 2008 - ؛. - Prosperi, 2006, Ronfort et al., 1998 لذا هدف از این تحقیق - 1 شناسایی تنوع ژنتیکی و پلی مورفیسم درون گونهاي یونجه بر اساس پروتئینهاي کل و - 2 معرفی جمعیت هایی است که از تلاقی آنها میتوان به بالاترین میزان هتروزیس رسید.
مواد وروشها
از بذر21 جمعیت وحشی ایرانی موجود در بانک ژن منابع طبیعی براي مطالعه پروتئینهاي کل استفاده گردید. پس از رشد کافی بذرهایی که در گلدانها کشت شده اند از 180 ژنوتیپ متعلق به 18 جمعیت مورد مطالعه - هر اکسشن 10 ژنوتیپ - به میزان یک گرم برگ از هر ژنوتیپ جدا گردید. در این تحقیق الکتروفورز پروتئینهاي کل به روش SDS-PAGE - الکتروفورز ژل پلیاکریلآمید دودسیل سولفات - انجام شد . - Laemmli, 1970 - اطلاعات حاصل از پروتیینهاي کل به صورت باندهاي مجزاي پروتئینی براي هر ژنوتیپ روي ژل پلیاکریل آمید نمایان گردید. جایگاه هر یک از این باندها بر روي ژل از طریق حرکت نسبی آنها مشخص و به صورت اعداد کمی بیان گردید. بر اساس وجود - عدد یک - یا عدم وجود هر باند - عدد صفر - در فواصل مختلف، نسبت به تشکیل ماتریس داده ها اقدام گردید.
فراوانی باندها، نسبت تعداد باندهاي پلیمورف نسبت به تعداد کل باندها و پلیمورفیسم باندها با نرم افزار - Rohlf, 2004 - NTSYS-pc محاسبه شد. تسهیم گوناگونی ژنتیکی درون و میان گروهی توسط آزمون واریانس ملکولی AMOVA - ؛ - Excoffier et al., 1992 و برنامه نرم افزاري ARLEQUIN 1.1 - ؛ - Schnieder et al., 1997 تعیین شد. فاصله ژنتیکی میان جمعیتها بر اساس معادله Nei, - Nei - 1978 برآورد شد. از آزمون Neighbor-Joining با نرم افزار - Tamura et al., 2007 - MEGA و همچنین بررسی همبستگی فاصله صفات با یکدیگر از تست مانتل - Mantel, 1967 - نیز استفاده گردید.
نتایج و بحث
الگو الکتروفورز پروتئینهاي کل یونجه درمیان 21 جمعیت مورد مطالعه در کل 44 باند نشان داد. وزن ملکولی باندها از 6606 تا 269153 دالتون متغیر بود. دو جمعیت ارومیه3 و مسجد سلیمان با 42 باند بیشترین تعداد باندها و دو جمعیت کردستان و تبریز1 با 34 باند کمترین تعداد باندها را به خود اختصاص دادند - جدول . - 1 هیچ باند نادري در میان جمعیتهاي مختلف مشاهده نگردید. میانگین درصد پلیمورفیسم %25/43 بود که کمترین درصد پلیمورفیسم مربوط به جمعیتهاي کرج1 و ارومیه2 با %6/82 و بیشترین درصد پلیمورفیسم مربوط به جمعیتهاي مراغه و اهر با %40/91 میباشد. میانگین تعداد باندهاي پلیمورف نسبت به کل باندها در کلیه جمعیتها از 0/030 تا 0/172 متغیر و به ترتیب مربوط به کرج1 و اهر بود. نتایج این پژوهش حاکی از وجود تنوع ژنتیکی قابل ملاحظهاي در بین جمعیتهاي مختلف یونجه است.
چنین مقادیري از گوناگونی در پروتئینهاي گیاه، قابل مقایسه با نتایج پروسپري - Prosperi 2006 - است که تنوع ژنتیکی 103 جمعیت طبیعی از یونجه در اسپانیا مطالعه نموده است. او با بررسی تنوع ژنتیکی و مورفولوژیکی منابع ژنتیکی وحشی .M. sativa - که به ویژه از کنار جادهها و زمینهاي مخصوص چرا و آبیاري شده جمع آوري شده بودند - ، اختلاف مهمی بین جمعیتهاي وحشی و زراعی مشاهده نمود. اما به دلیل وجود جریان ژن بین ارقام وحشی و زراعی، شباهت زیادي در جمعیتهاي پیدا کرد. پروسپري - Prosperi, 2006 - پیشنهاد میکند که گونههاي هیبرید وحشی یونجه به دلیل تنوع ژنتیکی بالا و مقاومت در برابر چراي گله و خشکسالی براي استفاده در برنامه هاي اصلاحی مناسب هستند. این پژوهشها تاکید میکنند در برنامههاي اصلاحی یونجه میبایست تنوع ژنتیکی ارقام بوسیله استفاده از والدین مختلف افزایش یابد.
افزایش اساس ژنتیکی براي اصلاح یونجه میتواند بوسیله کاربرد سیستماتیکی ژرمپلاسم که الگوي پروتئینی متفاوتی داشته و ویژگیهاي کمی بهتري دارند حاصل شود. براساس یافتههاي گاردینر و فورد - Gardiner and Forde, 1988 - اختلاف موجود در فراوانی باندها در افراد و به تبع آن در جمعیتهاي مختلف ناشی از تفاوت در تعداد ژنهاي کد کننده پروتئینهاي گیاه است.براي تشریح الگوي تمایز، فاصله ژنتیکی بین جمعیتها براساس برآورد unbiased فاصله ژنتیکی Nei در جمعیتهاي مناطق مختلف محاسبه شد. براي تشریح الگوي تمایز از فاصله ژنتیکی بین جمعیتها ازروش NJ نیز استفاده شد. در دندروگرام حاصل، کلیه جمعیتهاي مورد بررسی به 2 کلاستر عمده تقسیم شدند - شکل . - 3 همانگونه که مشاهده میشود خرمآباد بیشترین فاصله ژنتیکی را نسبت به سایر جمعیتها نشان داد.
ضرایب همبستگی جفت ماتریسهاي فاصله ژنتیکی و جغرافیایی جمعیتهاي یونجه با استفاده از آزمون مانتل محاسبه شد. همبستگی بین ماتریسهاي فاصله هاي پروتئینهاي کل و جغرافیایی مناطق مختلف بسیار کم بود که از لحاظ آماري نیز معنی دار نبود R=0/028 - ، . - =0/1 پس در نتیجه گیري کلی مشاهده میشود که رابطه جغرافیایی با ویژگیهاي باندهاي پروتئینهاي کل مناطق مختلف به وسیله آزمون مانتل ثابت نشد. عدم وجود ارتباط بین تنوع ژنتیکی و توزیع جغرافیایی در گیاهان مختلفی گزارش شده است - Alipour et al., 2002; Javaid et . - al., 2004; Sihag et al., 2004; Malik et al., 2009
با توجه به این واقعیت که در بسیاري از گیاهان، گوناگونی پروتئینهاي کل ارتباطی با توزیع جغرافیایی و عوامل اکولوژیکی نشان نمیدهند، این مارکر میتواند ابزار مفیدي براي شناسایی جمعیتهاي مناسب براي انجام دورگگیري باشد. زیرا تاکنون مطالعات بسیاري صورت گرفته تا مارکرهاي مناسبی براي گیاهان مختلف شناسایی گردد که تحت تأثیر عوامل محیطی نباشند. با توجه به اینکه در این پژوهش کمترین درصد پلی مورفیسم مربوط به جمعیتهاي کرج1 و ارومیه2 با %6/82 و بیشترین درصد پلیمورفیسم مربوط به جمعیتهاي مراغه و اهر با %40/91 بود. این جمعیتها و نیز جمعیتهاي اهر- کرج1 و اهر - خرم آباد که بیشترین فاصله ژنتیکی با یکدیگر را داشتند براي ایجاد تنوع ژنتیکی و آزمایشهاي تلاقی در پروژههاي اصلاحی پیشنهاد می شوند.
