بخشی از مقاله
مقدمه
بابونه رومی (Anthemis sp) گیاهی علفی، چند ساله و از خانواده Asteraceae است. مصرف بابونه ( آلمانی و رومی) از گذشته دور در جهان مستند است و در فارماکوپه هاي 26 کشور آمده است .(22) این گیاه، مدیترانهاي بوده و منشاء آن پرتغال، فرانسه و الجزایر است و در حال حاضر، مصرف سالانه بابونه در جهان شامل بابونه آلمانی و رومی، بیش از 4 هزار تن گل خشک است(.(1 بابونه یکی از مهم ترین داروهاي شناخته شده توسط انسان و یکی از پرمصرفترین گیاهان دارویی در اروپا، خاورمیانه،
آمریکاي شمالی، استرالیا و کشورهاي آفریقایی است و بر این اساس در چند دهه اخیر در مناطق مختلف جهان به ویژه در کشورهاي اروپایی تحقیقات زیادي پیرامون جنبههاي بهزراعی و بهنژادي این گیاه انجام گرفته و همه ساله شاهد انواع محصولات تولیدي از این گیاه می توان بود. بهمین دلیل و با توجه به کاربرد روز افزون آن در صنایع داروسازي، آرایشی و بهداشتی، عطرسازي و تهیه چاشنیهاي غذائی، بررسی تنوع ژنتیکی بابونه جهت
35
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
اصلاح و دستیابی به ژنوتیپهاي برتر، امري ضروري به نظر میرسد.
تنوع ذخایر ژنتیکی علاوه بر کمک به پایداري پوشش گیاهی در مقابل تنشهاي ناشی از عوامل زنده و غیر زنده، در اصلاح ارقام و دستیابی به ژنوتیپهاي برتر نیز اهمیت دارد .(15) نشانگرهاي بیوشیمیایی از دهه 1950 میلادي براي مطالعه گیاهان زراعی به صورت گستردهاي مورد استقبال قرار گرفت. از این نشانگرها براي شناسایی گونههاي مختلف گیاهی، تفکیک هیبریدها، تعیین خلوص واریتهها، بررسی روابط تکاملی و تعیین میزان حساسیت گیاه نسبت به تغییرات و تنشهاي محیطی استفاده میشود.
نشانگرهاي آنزیمی یکی از مهم ترین نشانگرهاي بیوشیمیایی هستند که در سطح وسیع مورد استفاده قرار میگیرند. در مطالعاتی که بر پایه این نشانگرها انجام میشود از چندشکلی آیزوزیمی((isozym polymorphism
استفاده میشود .(20)
ایزوآنزیمها اشکال متفاوت و قابل مشاهده الکتروفورزي آنزیمها هستند که توسط ژنهاي متفاوت و جایگاههاي متفاوت ژنی کد میشوند. هر ژن میتواند در یک مکان ژنی، آللهاي متفاوتی داشته باشد که این آللها با تغییرات جزئی، پروتئینهاي تغییر یافته را کد میکنند. این پروتئینها زیر دستهاي از ایزوزیمها یعنی آلوزیمها هستند که ناشی از تفاوتهاي آللی اند. بررسی گوناگونی آلوزیمی که ناشی از تغییرات در توالیهاي DNA رمز کننده پروتئین میباشد، از روشهاي متداول در زیستشناسی جمعیتهاي گیاهی است(23 و .(25
آنزیم پراکسیداز به شماره اندکس (EC1.11.1X) و از گروه آنزیمهاي اکسیدوردوکتاز است. گیاهان در برابر عوامل تنشزاي محیطی پروتئینهایی با نام کلی پروتئینهاي وابسته به عوامل بیماريزا ( (PRPs: Pathogen Related Proteins
تولید میکنند. این پروتئینها به گروههاي مختلفی تقسیم میشوند. تحقیقات نشان دادهاند که اعضاي یک تا پنج این
پروتئینها (PRP1-PRP5) فعالیت آنزیمی ندارند ولی از
PRP6 تا PRP11 همگی داراي فعالیت آنزیمی هستند و آنزیم پراکسیداز در خانواده PRP9 قرار دارد 12)، 13 و .(24 در همین رابطه فعالیت آنزیم پراکسیداز در پسته رقم احمدآقایی آلوده به قارچ آسپرژیلوس( (10، سیبهاي رقم زرد آلوده به باکتري سودوموناس((2 و قارچ پنسیلیوم و خیارهاي آلوده به فوزاریوم((9 مورد بررسی قرار گرفته است. حداکثر فعالیت این آنزیم در فصول سرد سال گزارش شده است. با استفاده از این آنزیم میتوان تأثیر تنش سرما بر گیاهان را مطالعه کرد و از این طریق میتوان به گیاهانی مقاوم تر به سرما نیز دست پیدا کرد( .(4 آنزیم پراکسیداز، از مهم ترین آنزیمها در سیر تحولات فیزیولوژیک گیاهان میباشد و به دلیل فراوانی باندها و نیز امکان وضوح باندها جهت مطالعات ایزوزیمی، همواره از جایگاه خاصی برخوردار بوده و بسیاري از محققین براي بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان از تفسیر زیموگرامهاي الکتروفورزي این آنزیم استفاده کرده اند 5)، 6، 7، 19 و .(21 البته براي بررسی تنوع ژنتیکی، تنها از آنزیم پراکسیداز استفاده نمیشود و گاهی، سایر آنزیمهاي گیاهی به عنوان مارکرهاي شیمیایی براي بررسی تنوع ژنتیکی مورد مطالعه قرار میگیرند(5، 11، 16، .(17
هدف از انجام این تحقیق شناسایی تنوع ژنتیکی و پلیمورفیسم درون گونهاي و میان گونهاي بابونه با استفاده از آنزیم پراکسیداز است تا از این طریق بتوان کارآیی آنزیم پراکسیداز را به عنوان یک نشانگر مناسب جهت بررسی تنوع ژنتیکی گونههاي متفاوت بابونه مورد مطالعه قرار داد.
همچنین هدف دیگر، معرفی مناسبترین والدین جهت هیبریداسیون است تا از این طریق و با استفاده از مطالعات آتی، مانند انتقال ژن بتوان جهت اصلاح گیاه دارویی بابونه اقدام نمود.
مواد و روشها
36
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
بذر جمعیتهاي مورد مطالعه از بانک ژن مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور تهیه گردید. جمعیتها شامل شش جمعیت از گونه A. triumfetti از استانهاي مازندران، گلستان و آذربایجان غربی، دو جمعیت از گونه A. haussknechtti از استانهاي ایلام و گلستان و یک جمعیت از گونه A. pseudocotula از استان گلستان بود.
مشخصات جغرافیایی و اقلیمی هر منطقه در جدول 1 آمده است. بذور ابتدا نشاکاري شده و بعد از انتقال به مزرعه تحقیقاتی واقع در ایستگاه البرز کرج( مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور) در قالب طرح بلوکهاي کامل تصادفی در 10 تکرار کشت شدند. پس از رشد کافی و رسیدن به اندازه مورد نظر، نمونهبرداري در اردیبهشت ماه از بوتههاي یکساله انجام گرفت. از 90 نمونه متعلق به نه
جمعیت مورد مطالعه(از هر جمعیت 10 تکرار) به میزان یک گرم برگ جدا شد و به نسبت 1:2 با محلول استخراج
1 EDTAII ) درصد، 1 pvp40 درصد و مرکاپتواتانول 1
درصد) به خوبی در هاون سرد همگن شد. نمونهها با دور
4000 و به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شده و عصاره آن خارج گردید. الکتروفورز به روش ژل پلی آکریل آمید حاوي ژل با غلظت 12 درصد انجام شد. از هر نمونه به میزان 70 میکرولیتر در داخل هر چاهک تزریق و ولتاژ منبع الکتریکی روي حالت max و آمپر بر روي 90 میلیآمپر(
براي هر دو ژل) تنظیم شد. هنگامی که حرکت آنزیم درژل به 8 سانتیمتر رسید، ژل از دستگاه جدا شده و درون محلول پراکسیداز گذاشته شد. بعد از حدود 12 ساعت ژل، از این محلول خارج شده و در آب مقطر قرار داده شد.
اطلاعات حاصل از ژل آنزیم به صورت لوکوسهاي PXA، PXB و PXC نشان داده شد و با توجه به این سه لوکوس و با شمارش تعداد باندهاي به وجود آمده در هر لوکوس، ماتریس دادهها ترسیم گردید. میانگین تعداد آلل در هر لوکوس((Na، تعداد آللهایی با فراوانی مساوي یا بیش از
25 درصد و 50 درصد و آللهاي نادر( با فراوانی کمتر و یا مساوي 0/05 درصد) ، هتروزیگوسیتی و درصد
پلیمورفیسم با نرم افزار Gene Alex محاسبه گردید.
تسهیم گوناگونی ژنتیکی درون و میان گروهی توسط آزمون واریانس مولکولی((AMOVA و برنامه نرمافزاري
ARLEQUIN 101 تعیین گردید. اهمیت هر جزء واریانس با آزمون Excoffier مطالعه و فاصله ژنتیکی براساس معادله Nei برآورد گردید. با استفاده از فاصله ژنتیکی، تجزیه به مولفههاي اصلی و تجزیه خوشهاي به روش
UPGMA انجام گرفت.
براي معرفی گیاهان مورد مطالعه، از حرف اول نام گونه و سپس نام شهر محل جمع آوري گیاه استفاده شد.
نتایج
تفسیر زیموگرام پراکسیداز از روش Thiebaut و همکاران انجام شد. ژل پراکسیداز به وسیله 3 لوکوس ژنی رمز میشود، به طوري که دو زون داراي فعالیت کافی و پایدار هستند و تحت عنوان PXB و PXC مورد بررسی قرار میگیرند و زون سوم((PXA وابسته به فصل میباشد که با مشاهدات صورت گرفته بر روي ژلهاي پراکسیداز در این تحقیق لحاظ گردید. در لوکوس PXA اختلافات آللی وجود نداشت و تنها در جمعیت گرگان از گونه A. pseudocutula فراوانی آلل A و B برابر با 0/500 بود.
لوکوس PXB با 5 آلل، داراي اختلافات آللی قابل توجهی بود به طوري که فراوانی آللی از 0/000 تا 0/800 متغیر بود.
بیشترین فراوانی آللی مربوط به آلل B درگونه A. haussknechtii و در جمعیت ایوان((0/800 و کمترین فراوانی، مربوط به آلل A در گونه A. triumfetti و در جمعیتهاي گرگان و رامیان((0/050 بود. در لوکوس PXC
چهار آلل دیده شد که بیشترین فراوانی مربوط به آلل A در گونه A. triumfettiو در جمعیت زیراب (0/875) و
کمترین فراوانی در آلل D در جمعیت رامیان متعلق به گونه (0/050)A. triumfetti بود. در مجموع سه آلل نادر با فراوانی 0/050 در آللهاي A و D گونه A. triumfetti (در لوکوسهاي PXB و ( PXC دیده شد. چهار آلل مختص به
37
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
محل در گونههاي triumfetti A. و A. pseudocutula نیز مشاهده شد(جدول .(2
متعلق به جمعیت گرگان و در لوکوسهاي PXA و PXB
جدول -1 مشخصات جغرافیایی و اقلیمی مناطق مورد مطالعه
شهر استان ارتفاع طول عرض میانگین حداکثر حداقل حداکثر حداقل
(m) جغرافیایی جغرافیایی بارندگی دماي دماي رطوبت رطوبت
سالانه((mm سالانه سالانه (%) (%)
گرگان گلستان 160 36/83 54/76 554/62 25/23 13/07 81/87 53/63
ایوان ایلام 1140 33/81 46/28 554/14 22/72 11/6 54/2 27
زیراب مازندران 1900 36/04 50/5 600 10 5، 7 75 65
رامیان گلستان 230 37/01 55/13 554/62 23/25 13/07 81/87 53/63
ارومیه آذربایجان غربی 1332 37/35 45/03 260/28 18/4 5/63 69/9 23/9
جدول شماره-2 فراوانی آللی در 9 جمعیت از 3 گونه Anthemis بر اساس داده هاي آنزیمی
لوکوس آلل -Hگرگان -Hایوان -Pگرگان -Tگرگان- T 1گرگان2 -Tرامیان -Tزیراب -Tارومیه1 -Tارومیه2
PXA A 0/00 0/00 0/500 0/00 0/00 0/00 0/00 0/00 0/00
B 0/00 0/00 0/500 0/00 0/00 0/00 0/00 0/00 0/00
A 0/300 0/00 0/550 0/050 0/100 0/050 0/500 0/150 0/450
PXB B 0/700 0/800 0/450 0/250 0/500 0/550 0/500 0/750 0/550
C 0/00 0/200 0/00 0/250 0/400 0/400 0/00 0/100 0/00
D 0/00 0/00 0/00 0/350 0/00 0/00 0/00 0/00 0/00
E 0/00 0/00 0/00 0/100 0/00 0/00 0/00 0/00 0/00
A 0/667 0/800 0/150 0/350 0/800 0/350 0/875 0/350 0/300
PXC B 0/333 0/200 0/850 0/400 0/200 0/350 0/125 0/00 0/250
C 0/00 0/00 0/00 0/150 0/00 0/250 0/00 0/650 0/450
D 0/00 0/00 0/00 0/100 0/00 0/050 0/00 0/00 0/00
جدول-3 جدول تکثر ژنتیکی در 9 جمعیت از 3 گونه Anthemis مورد مطالعه
تعداد تعداد آللهایی تعداد موثر ضریب آللهاي مختص تعداد آللهایی تعداد آللهایی هتروزیگوسیتی پلی مورفیسم
جمعیت مشاهده
آلل((Na با فراوانی %5≥ آلل((Ne شانون((I به محل((Nr بافراوانی%25 ≤ با فراوانی %50≤ (%p)
شده((Ho
-Hگرگان 1/333 1/333 1/175 0/416 0/00 0/00 0/00 0/288 %66/67
-Hایوان 1/333 1/333 0/980 0/334 0/000 0/000 0/000 0/212 %66/67
-Pگرگان 2/000 2/000 1/774 0/601 0/667 0/000 0/000 0/417 %100
-Tگرگان1 3/000 3/000 2/340 0/896 0/667 0/333 0/667 0/475 %66/67
Tگرگان2 1/667 1/667 1/248 0/481 0/000 0/000 0/000 0/300 %66/67
-Tرامیان 2/333 2/333 1/792 0/692 0/000 0/333 0/667 0/408 %66/67
-Tزیراب 1/333 1/333 1/093 0/357 0/000 0/000 0/000 0/240 %66/67
-Tارومیه1 1/667 1/667 1/172 0/459 0/000 0/000 0/333 0/287 %66/67
-Tارومیه2 1/667 1/667 1/599 0/585 0/000 0/000 0/333 0/380 %66/67
38
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
جدول-4 ماتریس برآورد نااریب فاصله ژنتیکی (NEI) در میان 9 جمعیت از 3 گونه Anthemis بر اساس داده هاي آنزیمی
جمعیتها -Hگرگان -H ایوان -P گرگان -T گرگان1 -T گرگان2 -T رامیان -T زیراب -T ارومیه1 -T ارومیه2
-Hگرگان 0
-Hایوان 0/069 0
-Pگرگان 0/49 0/864 0
-Tگرگان1 0/373 0/371 0/633 0
-Tگرگان2 0/131 0/053 0/890 0/299 0
-Tرامیان 0/224 0/166 0/622 0/203 0/156 0
-Tزیراب 0/070 0/160 0/708 0/528 0/147 0/427 0
-Tارومیه1 0/384 0/325 1/095 0/610 0/456 0/232 0/469 0
-Tارومیه2 0/207 0/393 0/489 0/486 0/467 0/259 0/279 0/121 0
