بخشی از مقاله
چکیده
روشهای آزمایشی مرسوم برای مطالعه اثرات آنتیبیوتیکها به دلیل خصوصیات منحصر به فرد این ترکیبات، مانند پایداری ذاتی در خاک و نحوه عمل آنها مناسب نمیباشد . تکنیک تحمل القائی در جامعه میکروبی - PICT - در مطالعات روابط پاسخ - غلظت بین آلایندهها و جوامع میکروبی خاک، بطور موفقیتآمیزی استفاده شده است. در این پژوهش، آنتیبیوتیکهای سولفامتوکسازول و اکسیتتراسایکلین در غلظتهای مختلف به یک خاک لوم شنی افزوده شدند و تحمل القائی در جامعه میکروبی با تکنیک PICT ارزیابی شد.
نتایج نشان داد که سولفامتوکسازول و اکسیتتراسایکلین باعث القاء تحمل در جامعه میکروبی شدند. القاء تحمل در تیمارهای سولفامتوکسازول در روز 4 انکوباسیون ایجاد گردیده و تا انتهای انکوباسیون ادامه داشت که نشاندهنده تغییرات ساختاری در جامعه میکروبی خاک میباشد. در حالی که تحمل القائی در تیمارهای اکسیتتراسایکلین در روزهای 1و 4 انکوباسیون توسعه یافت و با افزایش دوره انکوباسیون کاهش یافت که نشاندهنده کاهش اثر نامطلوب اکسیتتراسایکلین بر جامعه میکروبی با گذشت زمان میباشد.
مقدمه
آنتیبیوتیکهای داروئی که به صورت مواد طبیعی و سنتزی در طبیعت یافت میشوند به گروههای مختلف مانند سولفونامیدها1 و تتراسایکلینها2 تقسیمبندی میشوند
مهمترین منبع ورود آنتیبیوتیکها در محیط زیست، فعالیتهای انسانی مانند دفع فاضلاب و کاربرد کودهای دامی در کشاورزی و پرورش آبزیان میباشد
آنتیبیوتیکها به محض اینکه وارد محیط زیست میشوند میتوانند ساختار و عملکرد جوامع میکروبی خاک را تحت تأثیر قرار دهند. علاوه بر این، آنتیبیوتیکها باعث توسعه تحمل در جامعه میکروبی و گسترش ژنهای مقاوم به آنتیبیوتیک میشوند که به نوبه خود سلامت اکوسیستم و انسان را تحت تأثیر قرار میدهد
امروزه توجه بیشتری به اثرات زیست محیطی نامطلوب آنتیبیوتیکهای دارویی به دلیل سه ویژگی منحصر به فرد این ترکیبات شده است: - 1 - نحوه عمل آنتیبیوتیکها که فرض میشود میتوانند بر باکتریهای غیربیماریزا اثر کنند، - 2 - استفاده گسترده آنها مخصوصا در سیستم کشاورزی مدرن و صنعتی و - 3 - خطرات باالقوه آنها برای سلامتی انسان بواسطه افزایش ژنهای مقاوم میباشد
برای مطالعه روابط پاسخ- غلظت بین یک آلاینده و جامعه میکروبی خاک، تکنیک تحمل القائی در جامعه میکروبی1 - PICT - بطور موفقیت آمیزی استفاده شده است
تکنیک PICT بر اساس این فرض است که در معرض قرارگیری طولانی مدت جامعه میکروبی، به یک آلاینده باعث افزایش تحمل به آن آلاینده میشود . افزایش در تحمل سه اثر سمی محتمل را منعکس میکند: - - 1 از بین رفتن گونههای حساس بواسطه سمیت مستقیم آلاینده و تکثیر گونههای متحملتر، - - 2 تغییرات فیزیولوژیکی که باعث بقاء ریزجانداران دارای حساسیت کمتر میشود و - - 3 تغییرات ژنتیکی مانند کسب مواد ژنتیکی سیال که باعث ایجاد مقاومت بیشتر در جامعه میکروبی میشود. تغییرات در حساسیت کل جامعه میکرویی که PICT نامیده میشود اساساً بوسیله آلاینده مورد آزمایش متاثر شده و تحت تاثیر عوامل زیست محیطی قرار نمیگیرد. بنابراین، تکنیک PICT به عنوان یک ابزار سمشناسی اکولوژیک دارای حساسیت و اختصاصی بودن زیاد برای شناسایی اثرات آلایندهها میباشد
در این پژوهش، اثرات آنتیبیوتیکهای سولفامتوکسازول - SMX - 2 از خانواده سولفونامیدها و اکسیتتراسایکلین - OTC - 3 از خانواده تتراسایکلینها که دارای کاربرد گستردهتر در صنعت دامپروری هستند بر تحمل جامعه میکروبی خاک با تکنیک PICT ارزیابی شد.
مواد و روشها
نمونههای خاک از عمق صفر تا 20 سانتیمتری خاک یک مزرعه واقع در حومه شهرستان ارومیه که به مدت دو سال تحت آیش بود جمعآوری گردیده و با الک دو میلیمتری غربال و در درمای 4 درجه سانتیگراد تا زمان آنالیز نگهداری شدند. بافت خاک مورد آزمایش لوم شنی بوده و pH، مواد آلی کل و ظرفیت نگهداری مزرعه بترتیب 7/56، 0/95 درصد و 20 درصد بود.
اندازهگیری تکنیک PICT در دو مرحله انجام میگیرد: - 1 - فاز شناسایی 4 که در آن جوامع میکروبی بومی خاک در معرض غلظتهای افزایشی آلاینده به مدت طولانی قرار میگیرد و - - 2 فاز انتخاب5 که در آن جوامع میکروبی خاک که در مرحله قبل در معرض آلاینده قرار گرفته بودند - فاز انتخاب - ، استخراج گردیده و آنالیزهای تحمل با استفاده از یک آزمایش کوتاه مدت اندازهگیری میشود
فاز شناسایی: نمونههای خاک بطور مصنوعی با آنتیبیوتیکهای سولفامتوکسازول و اکسیتتراسایکلین در غلظتهای صفر، 1، 10، 25، 50 و 100 میلیگرم بر کیلوگرم خاک آلوده شدند . سپس تیمارهای خاک در تاریکی و در دمای 25 درجه سانتیگراد و در رطوبت 50 درصد ظرفیت زراعی انکوباسیون شدند.
فاز انتخاب: عصارههای میکروبی تیمارهای مختلف آنتیبیوتیکها بوسیله بافر تریس استخراج شده و به محیطهای کشت نوترینت- برات-گلوکز6 حاوی غلظتهای افزایشی آنتیبیوتیکها 0 - ، 0/1، 0/3، 3، 10، 30، 100 و 300 میلیگرم در لیتر - و محلول تری فنیل تترازولیوم کلراید - TTC - 7 اضافه شدند. محیطهای کشت در دمای 28 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت انکوباسیون شدند. تری فنیل فورمازون - TPF - 8 قرمز رنگ تولید شده بوسیله فعالیت دهیدروژنازی ریزجانداران با اتیل استات استخراج شده و جذب نور توسط اسپکتروفتومتر در طول موج 460 نانومتر اندازهگیری شد.
مقادیر فعالیت دهیدروژنازی به عنوان شاخصی از فعالیت میکروبی، در مقابل غلظت آنتیبیوتیکها در محیط کشت مایع رسم گردیده و با در نظر گرفتن 50 درصد ممانعت از فعالیت میکروبی، تحمل جامعه بدست آمد. در نهایت، با مقایسه تحمل جامعه میکروبی در معرض آنتیبیوتیک قرار گرفته با تحمل جامعه میکروبی نمونه شاهد - بدون آنتیبیوتیک - ، تحمل القائی آلودگی در جامعه میکروبی - PICT - تعیین شد. بنابراین - ,&50 - PICT بصورت اختلاف بین تحمل نمونه آلوده و نمونه غیرآلوده بیان میشود
نتایج و بحث
مقادیر IC50 محاسبه شده برای روزهای 1، 4، 11 و 21 روز انکوباسیون بین 0/27 تا 29/5 میلیگرم در لیتر برای همه تیمارهای سولفامتوکسازول بود - شکل . - 1 با افزایش غلظت آنتیبیوتیک، مقادیر IC50 بطور معنیداری - p 0. 05 - در طول دوره انکوباسیون افزایش یافت. تفاوت معنیداری در مقادیر IC50 بین غلظت 10 میلیگرم بر کیلوگرم خاک با غلظت 1 میلیگرم بر کیلوگرم و غلظت شاهد در همه زمانهای انکوباسیون وجود داشت که نشان دهنده این است که آنتیبیوتیک سولفامتوکسازول باعث افزایش تحمل جامعه میکروبی خاک در غلظت 10 میلیگرم بر کیلوگرم و غلظتهای بیشتر شده است.
بنابراین براساس این نتایج، غلظت 10 میلیگرم بر کیلوگرم به عنوان یک غلظت بحرانی آنتیبیوتیک سولفامتوکسازول در نظر گرفته می شود. نتایج ما در راستای نتایج هامسفر و همکاران - 2008 - میباشد که در آن با وجود کاهش در قابلیت دسترسی زیستی آنتیبیوتیک سولفادیازین، اثر این آنتیبیویتک بر ترکیب جامعه میکروبی با گذشت زمان افزایش یافت.
شکل -1 حداقل غلظت سولفامتوکسازول در ممانعت 50 درصدی از فعالیت دهیدروژناز - IC50 - در تیمارهای مختلف در طول دوره انکوباسیون. مقادیر IC50 از برازش یک معادله رگرسیونی بین غلظتهای آنتیبیوتیک در محیط کشت نوترینت- برات- گلوکز و فعالیت نسبی دهیدروژناز بدست آمد.
با محاسبه مقادیر PICT بصورت اختلاف بین IC50 نمونه آلوده با IC50 تیمار شاهد، افزایش در تحمل ریزجانداران خاک به آنتیبیوتیک سولفامتوکسازول مشاهده شده شد - شکل . - 2 در روز یک انکوباسیون افزایش تحمل کم بوده و فقط در بیشترین غلظت آنتیبیوتیک قابل مشهود بود.
