بخشی از مقاله
چکیده
کلی باسیلوز یکی از مهمترین بیماری های باکتریایی پرندگان است که عامل ایجاد کننده آن باکتری اشریشیاکلی می باشد. این بیماری سالانه خسارات اقتصادی فراوانی را به صنعت طیور وارد می کند. در طی دهه های اخیر، افزایش مصرف بی رویه آنتی بیوتیک ها سبب گسترش ژن های مقاوم و در نتیجه افزایش مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری ها گردیده است که منجر به کاهش کارایی داروها شده است.
این مطالعه با هدف شناسایی ژن های بتالاکتاماز و همچنین آنتی بیوگرام جدایه های اشریشیاکلی از موارد کلی باسیلوز طیور انجام شد. در این مطالعه100 باکتری اشریشیاکلی از جوجه های گوشتی مبتلا به کلی باسیلوز جداسازی شد و جدایه ها از نظر وجود ژن های بتالاکتاماز - bla-SHV, bla-TEM ,bla-CTX-M - به روش PCR و مقاومت آنتی بیوتیکی جدایه ها نسبت به 5 آنتی بیوتیک به روش انتشار دیسک تعیین گردید.
از 100 جدایه مورد بررسی به ترتیب60 جدایه - 60 درصد - ، 28 جدایه 28 - درصد - و4 جدایه 4 - درصد - واجد ژن های CTX-M ,TEM و SHV بودند. در نتایج تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی در بین جدایه ها، بیشترین مقاومت آنتی بیوتیکی نسبت به سفتازیدیم - 74 درصد - و کمترین مقاومت نسبت به کانامایسین - 21 درصد - مشاهده گردید. به علت گزارش های فزاینده افزایش مقاومت آنتی بیوتیکی، پرهیز از مصرف بی رویه آنتی بیوتیک ها و ترجیحا استفاده با دوز کمتر به همراه آنتی بیوتیک های سینرژیست توصیه می شود.
مقدمه
اشریشیاکلی باکتری گرم منفی متعلق به خانواده آنتروباکتریاسه است، که به عنوان فلور دستگاه گوارشی حیوانات مطرح می شود ولی بعضی از سویه های آن بیماریزا هستند - . - 1 اشریشیاکلی یکی از عوامل عمده بیماری در پستانداران و پرندگان می باشد - . - 2 کلی باسیلوز طیور یکی از بیماری های مهمی است که بعد از ایجاد ضایعه در دستگاه تنفسی به وسیله عواملی مانند مایکوپلاسماها و ویروس برونشیت عفونی به صورت ثانویه در طیور بروز میکند و با علایمی نظیر پریکاردیت و پری هپاتیت و عفونت کیسه های هوایی همراه بوده و باعث مرگ و میر در طیور می شود که خسارات اقتصادی فراوانی بر صنعت طیور وارد می سازد.
کلی باسیلوز یک بیماری شایع در واحدهای پرورش مرغ های گوشتی بوده که به دلیل مقاومت باکتریایی و استفاده بی رویه از داروها طی سالیان متمادی تلفات و خسارات زیادی را به بار آورده است - . - 5 آنتی بیوتیک های بتالاکتام بهترین گزینه برای درمان بسیاری از باکتری ها می باشند، آنها به دلیل قدرت سمیت پایین برای سلول های یوکاریوتی، ططیف اثر گسترده و اثر ضد میکروبی قوی، از پرمصرف ترین گروه آنتی بیوتیکی در دسترس هستند.
استراژی های مختلفی توسط باکتری ها به کار گرفته می شود تا از اثرات زیانبار آنتی بیوتیک ها مصون بمانند، یکی از این مکانیسم ها که در باکتری های گرم منفی علیه آنتی بیوتیک ها بکار گرفته می شود تولید آنزیم های بتالاکتامازی Beta- - - Lactamase enzymes است - . - 6 این آنزیم ها از طریق هیدرولیز حلقه بتالاکتام منجر به ایجاد مقاومت نسبت به این آنتی بیوتیک ها می شوند - . - 7 اعضای خانواده انتروباکتریاسه بتالاکتامازهایی را تولید می نمایند که توسط پلاسمید کد می شوند از نمونه این بتالاکتاماز ها میتوان SHV, CTX-M و TEM اشاره کرد - . - 8 در سال 1980 آمبلر آنزیم های بتالاکتامازی را در چهار گروه A,B,D و D طبقه بندی کرد.
بر این اساس آنزیم های SHV, CTX- و TEM در کلاس A قرار دارند - . - 9 بعضی ژن های بتالاکتاماز با طیف وسیع همانند blaCTX-M-15 در سرتاسر جهان دیده شده اند - . - 10 افزایش مقاومت آنتی بیوتیکی و بویژه ظهور سویه های مقاوم به چند آنتی بیوتیک، مشکلات بسیاری را برای درمان عفونت های ناشی از این ارگانیسم هم در عرصه پزشکی و هم دامپزشکی ایجاد کرده است، لذا شناسایی پروفایل مقاومتی سویه های مولد مقاومت لازم بنطر میرسد. با افزایش مقاومت گونه های اشریشیاکلی به آنتی بیوتیک ها، هدف از این مطالعه بررسی میزان شیوع ژن های مقاومتی bla-CTX-M و bla-TEM ،bla-SHV با استفاده از روش PCR و تعیین الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی در اشریشیاکلی های جدا شده از کلی باسیلوز طیور می باشد.
روش کار
جمع آوری نمونه: در این مطالعه تعداد 100 نمونه مدفوعی طیور با علایم اسهال و مشکوک به کلی باسیلوز از دانشکده دامپزشکی کرمان جمع آوری گردید. ابتدا نمونه ها در محیط مک کانکی آگار کشت داده شدند سپس گونه های مورد بررسی پس از جداسازی وکشت و آزمون های بیوشیمیایی مورد تایید قرار گرفتند - . - 11
تست تعیین حساسیت دارویی - آنتی بیوگرام - : آزمون حساسیت ضد میکروبی با استفاده از روش دیسک گذاری بر روی محیط مولر هینتون آگار مطابق روش ارائه شده توسط CLSI انجام شد - . - CLSI 2016 آنتی بیوتیک های مورد استفاده عبارت بود از سفتازیدیم، تتراسایکلین، کانامایسین، سفوتاکسیم. پلیت ها پس از کشت در دمای 37 درجه سانتی گراد گرم خانه گذاری شدند و بعد از گرم خانه گذاری قطر هاله های عدم رشد در اطراف دیسک های آنتی بیوتیک با در نظر گرفتن اصول CLSI اندازه گیری شد.
شناسایی ژن های بتالاکتامازی: به منظور شناسایی ژن های بتالاکتامازی، DNA ژنومی جدایه ها با استفاده از روش جوشاندن استخراج گردید - . - 12 برای شناسایی ژن های بتالاکتامازی شامل blaSHV, blaTEM و blaCTX-M در جدایه ها از پرایمرهای اختصاصی - جدول شماره - 1 و از روش مالتی پلکس PCR اسفاده شد - . - 12 واکنش PCR در حجم 25 میکرولیتر انجام شد. هر واکنش PCR شامل 200 میکرومول 10 ,dNTP پیکومول از هر پرایمر، 1/5 میلی مول در لیتر 0/5 ,Mgcl2 واحد آنزیم Tagو 50 نانوگرم DNA الگو می باشد.
واکنش مالتی پلکس PCR در دستگاه ترموسایکلر به شرح زیر انجام شد. یک سیکل 15 دقیقه در 95 درجه سانتی گراد - دناتوراسیون اولیه - سپس 30 سیکل شامل مرحله واسرشت شدن 30 ثانیه در 94 درجه سانتی گراد، مرحله اتصال 40 ثانیه در 61 درجه سانتی گراد و مرحله طویل شدن 2 دقیقه در 72 درجه سانتی گراد و نهایتا یک سیکل 10 دقیقه در 72 درجه سانتی گراد. محصولات PCR از نظر حضور وی زل آگارز 1 درصد الکتروفورز شده و در نهایت با استفاده از اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی و با دستگاه UV لومیناتور با اشعه ماوراء بنفش بررسی گردیدند.
