بخشی از مقاله
چکیده
آفات سخت بالپوش چغندرقند - Beta vulgaris L. - باعث خسارت شدید در مزارع چغندرقند اکثر نواحی زیر کشت دنیا می شوند. بهبود مقاومت از طریق انتقال ژنهاي مختلف از جمله ژنهاي Bt میتواند یک استراتژي مکمل و جایگزین براي مبارزه با آفات گیاهان زراعی به حساب آید. در این تحقیق دو رقم SBSI-5 و SBSI-4 جهت تراریختی به کمک Agrobacterium tumefaciens سویهGV3101 حاوي پلاسمید pBI35S-cry حامل ژن cry3Aa تحت کنترل راه انداز CaMV 35S و ژن گزینشگر nptII استفاده شد و برگ کامل به عنوان ریز نمونه در تراریختی بکار رفت.
محیط کشت حاوي غلظت ثابت کانامایسین - 100 mg/l - به استثناي مراحل اولیه گزینش، رشد جوانههاي غیر تراریخت - که منجر به حالت کلروز آنها میشود - محدود نمود و جوانههاي تراریخت احتمالی - سبز رنگ - به خوبی غربال شدند. آنالیز PCR با آغاگرهاي اختصاصی ژن هدف، حضور اولیه ژن cry3Aa در گیاهچههاي مقاوم به کانامایسین تایید نمود. گیاهچههاي PCR+ با %95 زنده مانی و بدون تغییرات مورفولوژي قابل ملاحظه به شرایط محیطی غیراستریل سازگار شدند. این گیاهان براي آنالیزهاي بیشتر به گلخانه منتقل شدند.
مقدمه
کشور ایران با داشتن سطح زیر کشتی معادل 190 هزار هکتار، 3/1 درصد از کل زمینهاي زیر کشت چغندر قند دنیا را در سال 2008 به خود اختصاص داده است که این موضوع به پراهمیت بودن جایگاه این نبات صنعتی در ایران دلالت دارد - انجمن صنفی کارخانههاي قند و شکر ایران، . - 1388 بر اساس آمار وزارت جهاد کشاورزي، سطح مبارزه شیمیایی با حشرات آفت در مزارع چغندرقند در سال 86 برابر 101 هزار هکتار بوده - بینام، - 1385 که نشاندهنده وسعت آلودگی مزارع چغندر قند به حشرات آفت و وارد آوردن خسارت قابل توجه به این محصول مهم است.
انتقال ژنهاي Bt به گیاهان زراعی موفقترین رهیافت در بین استراتژيهاي ارائه شده براي بهبود مقاومت گیاهان بر علیه حشرات آفت بوده و مقاومت به آفات دومین صفت مورد استفاده در فناوري گیاهان تراریخته می باشد . - Peferon 1997; Romeis et al. 2006 - گزارشهاي محدودي مبنی بر استفاده از بعضی ژن هاي ایجاد کننده مقاومت به حشرات آفت به خصوص ژنهاي - Bacillus thuringiensis - Bt در چغندرقند ارائه شده است.
Jafari و همکاران - 2009 - براي اولین بار انتقال ژن cry1Ab و ایجاد گیاهان چغندرقند تراریخته با مقاومت بهبود یافته در برابر آفت پرودنیا - Spodoptera littoralis - را گزارش نمودند. با توجه به منابع علمی قابل دسترس، گزارشی مبنی بر تراریختی چغندرقند با ژن - هاي - Bt به منظور مقاومت به آفات سختبالپوش وجود ندارد. در این تحقیق با استفاده از یک روش بهینه شده و کارا، براي اولین بار ژن cry3Aa - با کدونهاي بهینه شده - ، رمز کننده مقاومت به آفات سخت بالپوشان به واسطه آگروباکتریوم به گیاه چغندرقند انتقال داده شد.
مواد و روش ها
مواد گیاهی
در این تحقیق دو رقم مولتی ژرم دیپلوئید چغندر قند شامل SBSI-5 و SBSI-4 از موسسه اصلاح و تهیه بذر چغندر قند کرج - SBSI - تهیه و به منظور انتقال ژن استفاده گردید. براي تولید گیاهچه هاي کشت بافتی - شکل - 1C، به روش Norouzi و همکاران - 2005 - و با تغییراتی جزئی عمل شد. برگ کامل از این گیاهچهها جهت استفاده در فرایند تراریختی تولید شدند.
تهیه سازه مولکولی مناسب
به منظور ساخت سازه مولکولی حاوي ژن هدف، از حامل دوگانه pBI121 استفاده شد. پس از برش پلاسمید با آنزیمهاي برشی BamHI و SacI، ژن gusA از حامل pBI121 حذف گردید. ژن cry3Aa از پلاسمید - Salehi et al. 2008 - pGEM T-cry3a با استفاده از آغازگرهاي معین و توسط آنزیم pfu DNA polymearse تکثیر‘و سپس محصول PCR با آنزیمهاي برشی BamHI و SalI برش داده و در داخل حامل pBI121 نوترکیب شده با یک آداپتور، داراي جایگاه برش BamHI و SacI در دو انتها و جایگاه برشی آنزیم SalI در قسمت داخلی، درج گردید. سازه نوترکیب - pBI35S-cry3 - حاوي ژن هدف تحت پروموتر CaMV-35S و ژن گزینشگر nptII پس از تایید مولکولی، به Agrobacterium tumefaciens سویهGV3101 به روش ذوب-انجماد منتقل گردید
تلقیح ریزنمونهها با آگروباکتریوم، گزینش و باززایی گیاهچهها
تلقیح ریزنمونههاي برگ کامل - شکل - 1D بر اساس روش Jafari و همکارن - 2009 - عمل شد. پس از یک دوره گزینش60 روزه، گیاهچههاي تراریخته احتمالی به محیط ریشهزایی شامل محیط پایه - Murashige and Skoog 1962 - MS با ترکیب هورمونی - 1/5 mg/l - NAA و - 1/5 mg/l - IBA انتقال داده شدند. نهایتا گیاهچههاي ریشهدار شده جهت سازگاري به محیط طبیعی به گلدان انتقال یافتند. تمام نمونههاي کشت بافتی در اتاقک رشد با دماي 20±2°C و رطوبت %70 تحت تناوب نوري 12 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی نگهداري شدند.
آنالیز PCR گیاهچههاي گزینش شده
DNA ژنومی از برگ گیاهچه هاي مقاوم به کانامایسین و گیاه غیرتراریخته به روش دلاپورتا و همکاران - Dellaporta et al. 1983 - استخراج شد و به منظور تایید حضور انتقالی در گیاهچههاي تراریخته احتمالی، آزمون PCR به روش استاندارد با آغازگرهاي اختصاصی ژن cry3Aa براي تکثیر قطعه 1216 bp از ناحیه رمز کننده ژن هدف انجام گرفت و محصولات PCR مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج و بحث
گزینش آگروباکتريهاي نوترکیب - شکل - 2A در محیط حاوي کانامایسین - 50 mg/l - و همچنین آنالیز PCR براي باکتريهاي نوترکیب، حضور ژن هدف - نوار 1216 bp، هم اندازة کنترل مثبت - را تایید نمود. بدین ترتیب آگروباکتریوم تراریخته با پلاسمید نوترکیب حاوي ژن cry3Aa ایجاد شد و در فرآیند تراریختی هر دو ژنوتیپ چغندر قند استفاده گردید. بر اساس آزمون PCR با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی ژن هدف - cry3Aa - ، در گیاهان گزینش شده نواري به اندازه نوار کنترل مثبت تکثیر شد
و بدین ترتیب حضور اولیه ژن هدف در این گیاهان تایید گردید. با این حال براي اطمینان از درج کامل ژن هدف در ژنوم این گیاهان نیاز به آنالیزهاي دقیقتر میباشد. Lindsey و - 1990 - Gallois با تراریختی چغندرقند و تحت عامل گزینشی کانامایسین، در درصد پایینی از جوانههاي مقاوم به کانامایسین - %30 - حضور ژن هدف را تشخیص دادند.
Yang و همکاران - 2005 - نیز با تراریختی جداکشت غنچه گل حاوي جوانه القاء شده چغندرقند و تحت عامل گزینشی هیگرومایسین، میزان گیاهچههاي PCR+ براي ژن انتقالی را بین 15/2-38/7 درصد در ژنوتیپهاي مختلف چغندرقند گزارش کردند. ولی در مطالعه حاضر، در %60 گیاهان گزینش شده مورد بررسی در آنالیز PCR، ژن هدف تشخیص داده شد - دادهها نشان داده نشدند - و این نشان دهنده کارایی بالاي روش تراریختی مورد استفاده در این مطالعه است.
شکل-1 مراحل مختلف تراریختی چغندرقند با ژن :A .cry3Aa باکتريهاي نوترکیب حاوي ژن cry3Aa، :B گیاهچه هاي بذري 14 روزه، :C گیاهچه هاي درون شیشهاي حاصل از کشت جوانه رأسی، :D تلقیح ریزنمونههاي برگ کامل، :E گزینش گیاهچههاي تراریخته احتمالی - پیکان سبز رنگ - در محیط کشت حاوي کانامایسین، :F رشد گیاهچههاي گزینش شده احتمالا تراریخته، :G ریشهدار نمودن گیاهچه هاي تراریخته احتمالی در محیط ریشه زایی، :H گیاه PCR+ سازگار شده به شرایط محیطی غیراستریل.
شکل -2 آنالیز Clony PCR :A .PCR براي سلولهاي آگروباکتري نوترکیب. 1Kb DNA Ladder - Fermantas - :M، 2، :4 خالی؛ pBI35Scry3 :1 به عنوان کنترل مثبتک 3 و: 5 کلونی هاي باکتري نوترکیب، pBI121 :6 به عنوان کنترل منفی. :B آنالیز PCR براي گیاهان گزینش شده. 1Kb DNA :M Ladder - Fermantas - ، 1، 2، 3 و :4 گیاهان چغندرقند تراریخته T0 که نوار هم اندازه کنترل مثبت نشان دادهاند. pBI35Scry3 :5 به عنوان کنترل مثبت، 6 و :7 به ترتیب گیاه غیرتراریخته و نمونه بدون .DNA
گیاهان PCR+ در محیط کشت رشد طی 14 روز رشد طولی مناسب نشان دادند - شکل - 1F و به راحتی در محیط کشت ریشه زایی ریشهدار شدند - شکل . - 1G تقریبا %95 گیاهان ریشهدار به شرایط محیطی غیراستریل سازگار شدند - شکل - 1H و گیاهان سازگار شده هیچگونه تفاوت مورفولوژي قابل تشخیص در مقایسه با گیاه مادري نشان ندادند.
تعدادي از گیاهان به منظور ایجاد مقاومت به آفات سخت بالپوش، بوسیله ژن cry3Aa تراریخت شدهاند. Cornu و همکاران - 1996 - ژن cry3A با توالی تغییر نیافته - native cry3A - را به درخت صنوبر منتقل کردند. مطابق انتظار مقدار بیان ژن در گیاهان تراریخته و مقاومت حاصل پایین بود. در حالی که Genissel و همکاران - 2003 - ژن ساختگی cry3A را به همین گیاه انتقال دادند و گیاهان تراریخته حاصل مقاومت بسیار بالاي در برابر آفت نشان دادند.
Salehi و همکاران - 2008 - نیز ژن ساختگی cry3A با کدون هاي بهینه شده را به سیب زمینی انتقال دادند. ژن ساختگی نسبت به حالت وحشی در گیاهان تراریخته حاصل بیان بالایی داشت و گیاهان تراریخته حاصل مقاومت %37-81 بر علیه سوسک کلرادو نشان دادند. همچنین زارع و همکارن - 1388 - ژن ساختگی cry3Aa را جهت مقاومت به آفت سرخورطومی به گیاه یونجه انتقال دادند. گیاهان تراریخته حاصل داراي مقاومت بهبود یافته بودند. در تحقیق حاضر گیاهان گلدانی PCR+، براي تولید نسل بعدي و آنالیزهاي تکمیلی لازم به گلخانه منتقل شدند. این اولین گزارش در مورد تراریختی چغندر قند با ژن رمز کننده مقاومت به آفات سخت بالپوش - cry3Aa - میباشد.
