بخشی از مقاله
چکیده
دارابودن سیستمهاي تشخیصی دقیق و مقرون به صرفه، یکی از مهمترین ضروریات جهت تعیین راهبردهاي کنترل بیمارگرهاي گیاهی است. در تحقیق پیش رو، یک ریزآرایه آنتیبادي، یا ایمنیسنجی ریزآرایه - microarray immunoassay-MI - ، راهاندازي شده و کارایی آن در ردیابی چند بیمارگر مهم سیبزمینی شامل ویروس ایکس سیبزمینی - PVX - ، ویروس واي سیبزمینی - PVY - ، ویروس حلقهزرد پژمردگی گوجهفرنگی - TYFRV - ، Verticillium sp. و Ralstonia solanacearum نشان داده شد.
بدین منظور، ابتدا این بیمارگرها تکثیر و خالصسازي گردیدند. در مرحله بعد، آنتیبادي اختصاصی علیه هریک از آنها تولید و آي.جی.جی - IgG - هاي مربوطه خالصسازي شدند. سپس این آنتیباديها به روش تماسی روي اسلایدهاي شیشهاي تجاري پوشش دار، لکهگذاري شدند. در نهایت، این بیمارگرها به روش غیرمستقیم و پس از انکوبه کردن ریزآرایه با آنتیبادي ثانویه متصل به رنگ فلورسانت Cy3 به خوبی ردیابی گردیدند.
بر اساس نتایج به دست آمده، این ریزآرایه به راحتی قابل استفاده بوده و میتواند بیمارگرهاي مورد اشاره در بالا را با دقتی در حد پیکوگرم در آمودههاي آلوده به این بیمارگرها ردیابی نماید. در این آزمایشها، مقادیر ضریب تغییرات - CV - کمتر از ده درصد ارزیابی گردید. نتایج نشان میدهد که ریزآرایه راهاندازي شده در این تحقیق از نظر دقت و اختصاصیت مشابه روش مرسوم ایمنیسنجی الایزا است. این تحقیق، اولین گام در راستاي توسعه یک روش جدید براي ردیابی سرولوژیک بیمارگرهاي سیبزمینی محسوب میشود. بر اساس اطلاعات موجود، در این مطالعه براي اولین بار در جهان یک ریزآرایه آنتیبادي براي ردیابی بیمارگرهاي سیبزمینی راهاندازي گردید.
مقدمه
رعایت اصول پیشگیري و جلوگیري از ورود، شیوع و گسترش عوامل بیماریزا، بهترین و کمهزینهترین راه حل براي کاهش خسارت آنها میباشد . - 1 - در این راستا ضرورت دارد تا تولیدات و نهادههاي کشاورزي از جمله بذور و اندامهاي تکثیري به ویژه در مبادي ورودي و خروجی کشور دققاًیمورد بررسی و بازرسیهاي آزمایشگاهی قرارگیرند. تاکنون روشهاي مختلفی جهت تشخیص آزمایشگاهی بیمارگرهاي گیاهی توصیف شدهاند . - 9 - در حال حاضر عمدتاٌ از روش الایزا - - ELISA و واکنش زنجیرهاي پلیمراز - PCR - استفاده میگردد. به کمک این روشها تنها میتوان یک یا تعداد بسیار محدودي عامل بیمارگر را در یک واکنش، ردیابی نمود.
امروزه با استفاده از فناوريهاي نوین، امکان ساخت ریزآرایههایی - microarrays - فراهم شده است که میتوانند چندین نوع عامل بیمارگر را به طور همزمان در یک نمونه واحد در کمتر از چند ساعت و با دقتی در حد پیکوگرم ردیابی نمایند 2 - ؛ . - 8 آرایههاي پروتئینی از جمله دستاوردهاي فناوريهاي نوین میباشند که از آنها در مطالعات مختلف مولکولی استفاده شده است. آرایههاي آنتیبادي - antibody arrays - یکی از انواع آرایههاي پروتئینی محسوب میشوند.
در حال حاضر بعضی آرایههاي آنتیبادي به صورت تجاري در دسترس میباشند . - 7 - از این نوع ریزآرایهها براي ردیابی و تعیین کمیت بیان پروتئینها استفاده شده است 4 - ؛ . - 6 ریزآرایههاي آنتیبادي در حقیقت همان آزمون الایزا در شکل مینیاتوري میباشند که به آنها سنجش ایمنی ریزآرایه - microarray immunoassay-MI - نیز اطلاق میشود. نتایج نشان داده است که دقت ردیابی در روش MI مشابه آزمون معمول الایزا است. با اینحال این روش، داراي مزایاي فراوانی در مقایسه با روش مرسوم الایزا میباشد.
نخست، از نظر هزینه مواد مورد استفاده در مقایسه با روش معمول الایزا بسیار مقرون به صرفهتر است. بهعلاوه، مقدار نمونه مورد نیاز در این ریزآرایهها و زمان لازم براي حصول نتیجه بسیار کمتر از آزمون الایزا میباشد. هر چند انجام چند واکنش همزمان طی یک واکنش، در الایزاي استاندارد مقدور نمیباشد. به طور کلی، در صورت در دسترس بودن آنتیباديهاي مورد نظر، از این روش میتوان در بسیاري از مطالعات استفاده نمود . - 6 -
در حال حاضر، به کمک آنتیباديهاي تولید شده در کشور، امکان طراحی و ساخت تراشههاي پروتئینی و به کار گیري آنها در تشخیص دقیق و سریع عوامل بیمارگر گیاهی فراهم شده است. به همین منظور، در این تحقیق به کمک آنتیباديهاي تولید شده علیه چند بیمارگر مهم سیبزمینی شامل ویروس ایکس سیبزمینی - PVX - ، ویروس واي سیبزمینی - PVY - ، ویروس حلقهزرد پژمردگی گوجهفرنگی - TYFRV - ، Verticillium sp. و Ralstonia solanacearum یک ریزآرایه آنتیبادي راهاندازي گردید. در این تحقیق براي اولین بار در جهان، بیمارگرهاي گیاهی فوق الذکر با استفاده از ریزآرایههاي آنتیبادي - MI - ردیابی شدند.
مواد و روشها
در این تحقیق امکان ردیابی برخی بیمارگرهاي مهم سیبزمینی از جمله ویروسهاي PVX، PVY، TYFRV، قارچ Verticillium sp. و نیز باکتري Ralstonia solanacearum با استفاده از ریزآرایههاي آنتیبادي مورد بررسی قرار گرفت. مراحل تهیه ریزآرایههاي آنتیبادي به شرح زیر انجام گردید. ویروسها و باکتري مورد اشاره در بالا به کمک روشهاي توصیف شده قبلی تکثیر شده و آنتی سرم مربوط به هر یک از آنها تهیه گردید. لازم به ذکر است که جهت راهاندازي ریزآرایه آنتیبادي، علاوه بر تهیه آنتیسرم در خرگوش، از موش سفید نیز براي تولید آنتیسرم استفاده گردید.
3 - قارچ ورتیسیلیوم - جدایه سیبزمینی - ابتدا در محیط کشت مایع تکثیر شده و سپس پروتئین کل آن استخراج شده و پس از تزریق، آنتیسرم مربوطه تهیه گردید. در تمام تزریقهاي صورت گرفته، سوسپانسیون ویروسی یا باکتریایی با نسبت مساوي از روغن غیر کامل ادجوانت فروند - Freund’s complete adjuvant - ، مخلوط شده و پس از تشکیل امولسیون کامل، تزریق گردید. یک هفته پس از آخرین تزریق، خونگیري به عمل آمد. در مورد باکتري و قارچ مورد آزمون، از آنتیبادي تجاري تولید شده علیه این دو بیمارگر استفاده گردید.
لکهگذاري روي هر یک از اسلایدها با استفاده از دستگاه ریزآرایهساز غیر روبوتیک مدل MicroCasterTM Slide Microarrayer - ساخت Whatman Schleicher & Schuell، - USA و طبق روش توصیه شده توسط شرکت سازنده، انجام گردید. در این تحقیق، کیت آرایه پروتئینی - FASTTM PAK Protein Array Kit - و اسلایدهاي تجاري نوع Fast Slide ساخت شرکت مذکور به کار گرفته شد. با توجه به حساسیت بسیار بالاي ریزآرایهها و اثرات نامطلوب گرد و غبار هوا روي این سطوح و تداخل آنها با نتایج حاصله در زمان اسکن ریزآرایهها، کلیه مراحل کار در زیر هود استریل و با دستکش لاتکس انجام گردید. ابتدا، لکهگذاري آي.جی.جی مربوط به بیمارگرهاي مورد بررسی در پنج غلظت مختلف 2 - ، 1، 0/5 و 0/25 میلیگرم در میلیلیتر تهیه شده در بافر - PBS-T انجام گردید.
در این آزمون، یک لکه از بافر عصارهگیري و یک لکه از آي.جی.جی تهیه شده از سرم نرمال خرگوش به عنوان کنترل منفی روي اسلاید مستقر گردید. همچنین در لکهگذاري، آي.جی.جی تهیه شده از خرگوش علیه مخلوط پروتئینی به دست آمده از گیاه توتون و سیبزمینی سالم به عنوان کنترل مثبت به کار گرفته شد. سپس اسلایدهاي مورد آزمون با استفاده از محلول تجاري بلوکه نمودن فراهم شده توسط کیت، تیمار گردید. براي این منظور، هر اسلاید به مدت یک ساعت در این محلول قرار داده شد و سپس سه مرتبه و هر بار به مدت سه دقیقه در محلول PBS-T اتوکلاو شده، شستشو گردید.
در این مرحله، آمودههاي خالص هر ویروس و نیز آمودة پروتئینی به دست آمده از گیاه توتون و سیبزمینی سالم به طوري مخلوط شدند که غلظت هر یک از آنها در بافر PBS، به میزان 1 ng/ml شود. سپس اسلایدها به مدت دو ساعت، با این محلول تیمار گردیدند. اسلایدها پس از شستشو، به مدت دو ساعت در محلول آنتیبادي دوم - شامل آي.جی.جی تهیه شده علیه هر یک از بیمارگرهاي فوق در موش - قرار داده شدند. در این مرحله، سه غلظت 2 - ، 1 و 0/5 میکروگرم در میلیلیتر - مورد بررسی قرار گرفت. محلول آنتیبادي دوم، به صورت مخلوطی از آنتیباديهاي مربوط به هر یک از ویروسهاي مورد بررسی و نیز آنتیبادي مربوط به پروتئین گیاه سالم استفاده شد.
پس از تیمار اسلایدها با این محلول به مدت دو ساعت، شستشوي اسلایدها همانند مرحله قبل انجام گردید. سپس اسلایدها در آنتیبادي خرگوش ضد موش - rabbit anti-mouse - متصل به ترکیب رنگی RA-IgG-Cy3 - Cy3، تهیه شده از شرکت سیگما - قرار داده شدند. به منظور تعیین مناسبترین غلظت، سه غلظت 150 - ، 300 و 600 نانوگرم در میلیلیتر - از این آنتیبادي در محلول PBS-T تهیه و اسلایدها به مدت سه ساعت در معرض این آنتیبادي قرار گرفتند. پس از شستشو، هر یک از اسلایدها با استفاده از دستگاه اسکنر ریزآرایه، اسکن شدند. در این مرحله، عدد مربوط به فلورسانس نوري هر لکه و اثر زمینه - background - همان لکه، در طول موج 532 نانومتر تعیین گردید.
سپس به منظور به دست آوردن عدد فلورسانس نوري تصحیح شدة هر لکه، عدد مربوط به اثر زمینه هر لکه از عدد مربوط به سیگنال فلورسانس همان لکه، کسر شده و بدین ترتیب عدد تصحیح شده، محاسبه گردید . - mean F532-B532 - با توجه به این که در هر اسلاید، هر یک از لکهها داراي هشت تکرار متناظر بودند، لذا میانگین و انحراف معیار و نیز ضریب تغییرات - CV - دادههاي مربوط به تکرار هر یک از لکهها، محاسبه شد. نمونههایی که میانگین عدد تصحیح شدة آنها مساوي یا بیشتر از سه برابر میانگین عدد تصحیح شدة مربوط به لکه سرم نرمال خرگوش - شاهد منفی - بود، به عنوان نمونه آلوده در نظر گرفته شدند.
نتایج و بحث
دادههاي حاصل از اسکن ریزآرایهها به تفکیک شماره اسلاید مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس دادههاي به دست آمده، بهترین حالت جهت ردیابی بیمارگرهاي مورد نظر، به کارگیري غلظت 0/5 تا یک میکروگرم در میلیلیتر آنتیبادي اولیه در لکهگذاري، یک تا دو میکروگرم در میلیلیتر از آنتیبادي ثانویه و 300 نانوگرم در میلیلیتر از آنتیبادي خرگوش ضد موش متصل به رنگ Cy3 بود. استفاده از غلظتهاي بیشتر نتایج مطلوبی در بر نداشته و منجر به حالت اشباع گردید. این موضوع میتواند مربوط به بروز نوعی واکنش غیراختصاصی ناشی از بالا بودن غلظت آنتیباديهاي ثانویه و نیز آنتیبادي کانجوگیت باشد. همچنین غلظتهاي بهینه آنتیبادي در بیمارگرهاي مختلف تفاوت داشت.
به نظر میرسد تفاوت در غلظت بهینه - آنتیبادي اولیه و ثانویه - در ردیابی بیمارگرهاي مختلف عمدتاً به دلیل تفاوت در کیفیت آنتیسرمهاي تولید شده باشد. از اینرو، مطالعات بیشتر در آینده جهت تولید آنتیباديهاي با کیفیت و استفاده از آنها در ریزآرایههاي آنتیبادي جهت تشخیص سریع بیمارگرهاي گیاهی ضروري به نظر میرسد. در این مطالعه، میانگین، انحراف معیار و ضریب تغییر - CV - دادههاي به دست آمده محاسبه گردید. در تمامی موارد، مقدار CV دادههاي مورد بررسی بین یک تا سه درصد در نوسان بود که نشاندهندة قابل قبول بودن دقت دادهها است.
به طور کلی در ریزآرایههاي آنتیبادي، ضریب تغییر کمتر از 10 درصد نشاندهندة کنترل خوب شرایط آزمون و دقت بالاي روش میباشد . - 5 - به عبارت دیگر، وجود ضریب تغییر کمتر از 10 درصد در بین دادههاي حاصل از اسکن یک اسلاید، نشاندهندة یکنواختی نسبی شکل و مورفولوژي لکهها و نیز یکنواختی سطح ریزآرایههاي مورد استفاده از نظر ظرفیت اتصال پروتئینهاي آنتیبادي به آنها است. از این روش میتوان در تشخیص همه بیمارگرهایی که علیه آنها آنتیبادي تولید شده است، استفاده نمود.
