بخشی از مقاله
شناسايي نشانگرهاي مولکولي پيوسته با ژن(هاي) مقاومت به نماتد مولد سيست چغندرقند
چکيده
با توجه به اهميت وگستردگي نماتد مولد سيست چغندرقند (Heterodera schachtii Schmidt) در جهان و به منظور جلوگيري از کاهش قابل توجه محصول ريشه و قند ناشي از اين نماتد تلاشهاي زيادي صورت مي گيرد و مناسب ترين روش مديريت آن اصلاح ارقام مقاوم مي باشد. گونه هاي وحشي گروه procumbentes
در جنس Beta به دليل داشتن ژنهاي مقاومت به بيماري هاي مختلف چغندرقند ازجمله مقاومت به نماتد اهميت زيادي دارند. براي شناسايي نشانگرهاي مولکولي DNA پيوسته با ژن(هاي) مقاومت به نماتد مولد سيست چغندرقند از آغازگرهاي ١٠ نوکلئوتيدي و توالي هاي اختصاصي استفاده شد. براي اين منظور، در ابتدا جمعيت هاي درحال تفکيک براي ژن (هاي) مقاومت به نماتد انتخاب گرديدند. پس از کشت بذر، نشاء اين جمعيت ها با حدود ١٠٠٠ لارو نماتد در چند نوبت ، تلقيح شدند. گياهان مقاوم (با کمتر از ١٠ سيست ) و گياهان حساس(بابيشتر از١٠ سيست ) شناسايي و به دو گروه تقسيم شدند. در مرحله بعد با استفاده از آغازگرهاي انتخابي مانند: ١٠-OP-Y,١١-OP-B ,١٣-OP-D ,٠٢-OP-G, ١٥-OP-x, ٠٢-OP-x، ١٢١-Sat و اليگونوکلئوتيدهاي TGAACACCTTTCAAAT،CGTAAGAGACTATGA و ١٠٠ آغازگر از کيت هاي شرکت اپرون، آزمون PCR، انگشت نگاري نمونه ها و مقايسه الگوي نوارهاي DNAي دوگروه، انجام شد بين مقاومت در گياه و حضور نوار خاصي از توالي DNA تکثير شده، با نشانگر ١٢١-Sat، ٦٦.٦٤ درصد پيوستگي و هم چنين بين مقاومت در گياه و حضور نوار خاصي از توالي DNA تکثير شده، با نشانگر ١٣-OP-D، ٦٦.٩١ درصد پيوستگي مشاهده شد که اين دو نشانگر مي توانند در غربال ژنوتيپ هاي مقاوم در شرايط آزمايشگاهي استفاده شوند.
واژههاي کليدي: چغندرقند، مقاومت ، نماتد مولد سيست ، نشانگرهاي مولکولي
مقدمه
از مدتها قبل محصول چغندرقند تحت تأثيرخسارت آفات و بيماريهاي مختلفي ازجمله نماتد مولد سيست چغندرقند Heterodera schachtii) (Schmidt قرار گرفته است . اولين نشانه هاي بيماري، ضعف ، زردي و کاهش رشد است . بوته هاي آلوده کوتوله شده و ريشه هاي آنها کوچک، بدشکل ، داراي ريشکهاي فرعي بسيار افشان مي باشد و روي ريشه هاي فرعي سيست هاي سفيد رنگ رويت مي شود (١٩٩٨ .Mohamadi goltape et al). کاهش عملکرد ريشه چغندرقند در اثر حمله نماتدها حدود ١٠درصد برآورده شده که حدود ٩٠درصد اين کاهش مربوط نماتد مولد سيست است . بنابراين به عنوان يکي از مهم ترين عوامل بيماريزاي چغندرقند درجهان شناخته شده است (١٩٩٧ .Sandal et al). در ايران مناطقي از استانهاي خراسان، اصفهان، فارس، آذربايجان غربي ، کرمانشاه و کرمان، آلوده به اين نماتد هستند (١٩٩٤ .Ahmadi et al). با توجه به آن که روشهاي ارزيابي کلاسيک گزينش مقاومت به بيماري از نوع فنوتيپي بوده و وابسته به شرايط محيطي و يکنواختي عامل آلوده کننده هستند و در فصل خاصي از سال انجام مي گيرند و نيز بعضي از گياهان از عامل آلوده کننده به نحوي مي گريزند (Escape) و به ظاهر مقاوم تلقي مي شوند، از اين رو با استفاده از روشهاي مولکولي به عنوان روش تکميلي يا جايگزين مي توان گياهان در بردارنده ژن مقاومت را در سطح ژنوتيپي شناسايي نمود. بنابراين نشانگرهاي DNA مي توانند ابزارهاي مفيدي براي انتخاب ژنوتيپ هاي مقاوم باشند و باعث صرفه جويي در زمان ارزيابي و افزايش دقت انتخاب گردند (٢٠٠٣ Norouzi).
درون گونه هاي وحشي چغندر حداقل سه ژن مقاومت به نماتد روي کروموزومهاي مختلف بخش Procumbentes قرار دارند که شامل ژنHs١ در کروموزوم شماره يک هر سه گونه Procumbentes، ژنHs٢ در کروموزوم شماره هفت گونه Beta procumbens و B. webbiana و ژن Hs٣ در کروموزوم شماره هشت گونه B. webbiana مي باشد. ژنهاي مقامت به نماتد سيستي چغندرقند از خزانه ژني گونه هاي وحشي جنس Beta به درون لاين هاي اصلاحي وارد شدهاند .Kleine et al) 1998)
سالنتين و همکاران (١٩٩٤ .Salentijn et al)موفق به يافتن توالي هاي تکراري ١٢١-Sat شدند که با ژن مقاومت به نماتد سيستي چغندر پيوستگي شديدي دارد (١٩٩٧ Mesbah). هم چنين اين افراد تعدادي توالي آغازگر تصادفي شناسايي کردند، که با ژن فوقالذکر پيوستگي نشان مي دادند. هالدن و همکاران (١٩٩٧ .Hallden et al) از تکنيک RAPD با استفاده از تعدادي توالي آغازگر براي شناسايي ژن (هاي) مقاومت به نماتد سيستي چغندر بهرهبرداري نمودند. مصباح و همکاران (١٩٩٧ .Mesbah et al) موفق به شناسايي سه قطعه توالي DNA تکراري نام OPX2، 4-PB6 و 121-Sat در ژنوم گونه هاي وحشي چغندر از گروه Procumbentes شدند که با ژن (هاي) مقاومت به نماتد پيوستگي ژنتيکي داشتند.
کاي و همکاران (١٩٩٧ .Cai et al) با استفاده از نشانگرهاي ساتليت اختصاصي ژنوم موفق به جداسازي اولين ژن مسئول ايجاد مقاومت به نماتد بنام 1-Hs1pro شدند. با مقايسه توالي ناحيه رمزکننده ژن Hs1 در سه گونه Procumbentes مشخص شده است که بين B. procumbens و B. webbiana حدود ٩٦درصد و بين B. procumbens و B. patellaris حدود ٩٣درصد مشابهت توالي وجود دارد kleine et) (1998.al. ژن Hs1 با منشا گونه procumbens موسوم به 1-Hs1pro بوده که بيش از ساير منابع جهت انتقال به ارقام زراعي چغندرقند به کار رفته است . اين ژن مقاومتي تک ژني و غالب را ايجاد مي نمايد
(1998.Kleine et al). البته در بين نشانگرهايي که براي اين ژن تا به حال تعيين شده است گاهي اوقات ديده مي شود که گياهاني مقاوم به نماتد سيستي بوده ولي نشانگر مربوطه را نشان نمي دهند Salentijn) (١٩٩٥. بنابراين ضروري به نظر مي رسد که علاوهبر آزمون برخي از نشانگرهاي قبلي به دنبال نشانگرهاي جديد نيز بود. دراين تحقيق ، با کمک آغازگرهاي تصادفي RAPD و اليگونوکلئوتيدهاي انتخاب شده، هدف بررسي و شناسايي نشانگرهاي مولکولي است که به توان از آنها در غربال ژنوتيپ هاي مقاوم به نماتد در شرايط آزمايشگاهي بهرهبرداري نمود.
مواد و روشها
مواد گياهي مورد استفاده
ژنوتيپ W١٠٠٩ که يک لاين جابجايي (Translocation line) با منشاء B.procumbens مي باشد و داراي مقاومت عمودي نسبت به نماتد مولد سيست است . بذر گياهان حاصل از خودگشني ، هيبريدهاي به دست آمده از تلاقي لاين جابجايي (W١٠٠٩) با ارقام اصلاحي چغندرقند، شامل چهار تلاقي (MSC2×W1009)-1 ×٢٣١،
(9801×W1009)231× ،W1009(×٢٠٤٤٧) ×٢٣١ ، (W١٠٠٩×٢٠٣١٤) ×٢٣١، ارقام تجاري نماکيل (NEMAKIL) و رسول (RASOUL) به ترتيب به عنوان شاهد مقاوم و حساس در آزمايش ارزيابي مقاومت ژنوتيپ هاي منتخب چغندرقند نسبت به نماتد مولد سيست مورد استفاده قرار گرفتند.
مقاومت چند ژنوتيپ منتخب چغندرقند نسبت به نماتد مولد سيست در دو آزمايش جداگانه (درسال ١٣٨٤) در قالب طرح کاملاً تصادفي در شر يط گلخانه بررسي شد. در هر آزمايش از هر ژنوتيپ ٥٠ گياهچه توسط لاروهاي فعال سن دوم نماتد مايه زني شد. به هر گياهچه ١٠٠٠ لارو نماتد در چند نوبت مايه زني گرديد.
نه هفته پس از آخرين مايه زني لارو، تعداد سيست تشکيل شده روي ريشه و درون ماسه اطراف هر گياهچه شمارش و مبناي مقايسه مقاومت ژنوتيپ ها قرار گرفت . دادههاي به دست آمده با استفاده از نرمافزار آماري SAS تجزيه و تحليل شد.
استخراج DNA ژنومي گياه
نه گياه از مقاومترين و نه گياه از حساسترين گياهان تلاقي (W1009×20314)×231 براي تهية بالک ژنومي انتخاب گرديدند. هم چنين کلية گياهان مقاوم تلاقي هاي (W1009×9801)×231، (20447×W1009)231× ،W1009( ×20314)×231، 1-(W1009×MSC2)×231 و نيز حساسترين گياهان اين تلاقي ها جهت آزمون نشانگر مولکولي به صورت تک بوته انتخاب شدند. به علاوه از گياهان حاصل از خودگشني تک بوته هاي مقاوم لاين جابجايي هم براي تأييد نشانگر مورد آزمايش ، استفاده گرديد.
بعداز انتخاب گياهان بالک مقاوم و حساس، استخراج DNA آنها به روش نوروزي(٢٠٠٣) انجام گرفت و بعداز آزمون نشانگر روي آنها، جهت تعيين پيوستگي نشانگر موردنظر با ژن مقاومت روي تک بوته ها، DNA تمام گياهان مقاوم و حساس بوته هاي تلاقي هاي (W1009×9801)×231 ، (20447×W1009)231× ،W1009( ×20314)×231 ، 1-(W1009×MSC2)×231 نيز استخراج شدند.
آزمون RAPD– PCR
DNA ژنومي ، به همراه بافر PCR،dNTP ٢٠٠ ميکرو مولار، ٢٥ نانوگرم آغازگر و يک واحد آنزيم Smartaq پليمراز در حجم کلي واکنش ٢٥ ميکروليتر صورت گرفت .
آغازگرهاي مورد آزمون
آغازگرهاي تصادفي ١٥-OP-X, ٠٢-OP-X ١٠-OP-Y, ١١-OP-B ,١٣-OP-D ,٠٢-OP-G, و اليگونوکلئوتيدهاي TGAACACCTTTCAAAT، CGTAAGAGACTATGA مربوط به توالي تکراري ١٢١ -Sat و صد آغازگرتصادفي از کيت هاي C,D,F,G,M شرکت اپرون براي تکثير قطعات ژنومي استفاده شدند، تفکيک قطعات تکثيري با استفاده از الکتروفورز در ژل آگارز ١.٢ درصد انجام گرفت و ژلها در محلول اتيديوم برومايد يک ميلي گرم در ليتر به مدت ٢٠-١٠ دقيقه رنگ آميزي شده و نوارهاي DNA توسط لامپ ماوراي بنفش رؤيت گرديده و توسط دوربين عکس برداري شد.
تجزيه آماري
تجزيه و تحليل آماري جهت تعيين همبستگي بين نتايج حاصل از آغازگر ١٣-OP-D با آغازگر-Sat
١٢١ توسط نرمافزار Excel با تشکيل جدول صفر و يک که در آن يک نشانه حضور نوار موردنظر و صفر نشانه عدم حضور نوار موردنظر بود، انجام گرفت و ٨٨ درصد تعيين گرديد.
نتايج و بحث
نتايج نشان داد در هر دو آزمايش ژنوتيپ ها از نظر صفات فوق اختلاف معني داري با يکديگر دارند. آزمون چنددامنه اي دانکن در سطح يک ژنوتيپ ها را در سه گروه مقاوم، حساس و بسيارحساس دسته بندي کرد. منابع مقاوم 1010-W , 1009-W و رقم تجاري مقاوم Nemakil با کمترين تعداد سيست در گروه مقاوم و رقم تجاري رسول با برخي هيبريدهاي مورد بررسي جزو حساس ترين ژنوتيپ ها دسته بندي شدند. از بين آغازگرهاي تصادفي آزمون شده ، -OP
١٣-D در ناحية حدود bp ١٣٠٠ چندشکلي نشان داد.
به اين معني که گياهان مقاوم البته نه همه داراي نواري در حدود bp ١٣٠٠ بودند ولي اين نوار در گياهان حساس ديده نشد. شکل يک الگوي نواربندي نمونه ها توسط آغازگر ١٣-OP-D را نشان مي دهد.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1300 bp
