بخشی از مقاله
چکیده
تکنولوژي گیاهان ترانسپلاستومیک جایگاه مهمی در مطالعات علوم پایه و بیوتکنولوژي دارد. دست ورزي ژنتیکی ژنوم پلاستیدي به ویژه ژنوم کلروپلاست، مزایاي متعددي نظیر بیان بالا، توانائی بیان ژنهاي چندگانه و عدم انتقال ناخواسته ژن خارجی توسط دانه گرده را فراهم نموده است. با توجه به این ویژگیها، علاقه زیادي براي بهکارگیري این سیستمها جهت مصارف کشاورزي، صنعتی و پزشکی وجود دارد.
در این طرح از ماهیت پروکاریوتی کلروپلاست و توانایی آن در بیان mRNA هاي پلی سیسترونی به منظور تولید هم زمان چند پروتئین نوترکیب استفاده شد. از طریق تعبیه ي توالی داخلی اتصال ریبوزوم Site,IRES - ، ژن epsps جهش یافتهي باکتریایی با قدرت تحمل به علفکش گلایفوسیت در ناقل کلروپلاستی pKCZ و در کنار ژن aadA - ژن مقاومت به آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین و استرپتومایسین - قرار گرفت. به این ترتیب یک ساختار اوپرونی و تحت کنترل پروموتر prrn16 ساخته شد.
تراریختی کلروپلاستها به روش زیستپرتابی و بر روي گیاه توتون انجام گرفت. با انجام مراحل متعدد باززایی روي محیط انتخابی و آنالیزهاي مولکولی بر روي گیاهان حاصل حضور سازهي حاوي ژنهاي نامبرده در این گیاهان مورد تأیید قرار گرفت.
مقدمه
کلروپلاستها از اندامکهاي مهم سلولی هستند و در سلولهاي گیاهی و جلبکهاي تک سلولی وجود دارند. کاربرد تراریختی ژنوم کلروپلاستی در مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژي مورد توجه قرار گرفته است. استفاده از سیستم بیانی کلروپلاست داراي مزایاي فراوان و منحصر به فردي است که در سایر انواع تراریختی نظیر استفاده از فرمانتورهاي میکروبی، ردههاي سلولی پستانداران و تراریختی ژنوم هسته اي گیاه مشاهده نمیشود، از جمله این که ژنوم کلروپلاستی کوچک وبسیار پلی پلوئید است، به علاوه محدود بودن مسیرهاي تجزیهي پرتئین در کلروپلاست منجر به پایداري بیشتر پرتئینها در این اندامک میشود.
علاوه بر آن عدم وجود خاموشی ژن، توانایی بیان mRNA پلی سیسترونیک از یک پروموتر منفرد، ورود ژن تراریخت از طریق نو ترکیبی هومولوگی و در جایگاههاي ویژه که غیر فعال شدن ژن به علت اثرات مکانی را منتفی میسازد، نبود نیاز به بهینهسازي کدونی - مسئلهي ترجیح کدونی در کلروپلاست گیاهان عالی چندان قابل توجه نیست - واز همه مهمتر توارث تک والدي ژنهاي پلاستیدي در اکثر گیاهان که امکان فرار ژن به سایر گیاهان را به شدت کاهش میدهد. ولی ویژگی مهمی که در این تحقیق مورد توجه قرار گرفته است
ماهیت پروکاریوتی کلروپلاستها میباشد و این مسأله به این معناست که سیستم بیانی این اندامک مانند پروکاریوتها پلی سیسترونی است. بر این اساس با استفاده از روشهاي مهندسی ژنتیک، تراریختی ژنوم کلروپلاستی با چند تراژن و بیان هم زمان آنها امکان پذیر میباشد
در مطالعات گذشته تراریختی کلروپلاست با ژن epsps جهش یافته و به منظور مقاومت به علف کش گلایفوسیت با استفاده از گیاهان ترانسپلاستومیک انجام شده بود اما به دلیل اثرات جانبی گلایفوسیت، گیاه کامل ترانس پلاستومیک رشد نکرد . به منظور حل این مشکل،در این تحقیق یک اوپرون مصنوعی - واجد دو ژن - در ناقل مختص تراریختی کلروپلاست گیاه تنباکو - - pKCZ تعبیه شد.
یکی ازژنها aadA و دیگري ژن epsps دست ورزي شده است که کد کنندهي آنزیم انول پیروویل شیکیمات -3فسفات سنتاز میباشد. این آنزیم در باکتريها، قارچها و گیاهان در مسیر ساخت اسید آمینههاي حلقوي نقش کلیدي دارد و به وسیلهي علف کش گلایفوسیت - رانداپ - مهار میشود در حالی که نوع دست ورزي شدهي آن نسبت به علفکش فوق تحمل نشان میدهد.
در ادامهي کار تراریختی کلروپلاست گیاه توتون به عنوان گیاه مدل با سازهي مذکور و با استفاده از روش زیست پرتابی انجام گرفت. آنالیزهاي مولکولی گیاهان باززا شده حضور سازهي مورد نظر را تأیید کرد.
مواد و روشها
ژن epsps دست ورزي شدهي باکتریایی قبلا طراحی و در بانک ژنی تحت شمارهي ثبت شده است به علاوه ناقل pKCZ نوترکیب که در آن این ژن جایگزین ژن aadA شده است نیز ساخته شده است
در این بررسی با کمک طراحی آغازگر و تعبیه ي جایگاه داخلی اتصال ریبوزوم - IRES - ژن aadA در بالادست ژن epsps تغییر یافته کلون شد.در این حالت هر دو ژن تحت کنترل یک پروموتر و یک خاتمه دهنده قرار گرفتند و ساختاري مشابه اوپرون ایجاد گردید. انجام کلیهي مراحل کلونینگ با استفاده از روشهاي استاندارد صورت پذیرفت
تراریختی پلاستیدهاي توتون توسط سازهي ساخته شده با استفاده از تفنگ ژنی و طبق روش استاندارد - - BioRad انجام شد. به طور خلاصه برگهاي بمباران شده با ذرات طلا - به قطر 0/6 میکرون - ، پس از دو روز قرارگیري در شرایط نوري مناسب به قطعات کوچکتر بریده شده و در محیط مخصوص باززایی RMOP - حاوي اسپکتینومایسین - قرار گرفتند. در راستاي رسیدن به هموپلاسمی و دستیابی به گیاه ترانسپلاستومیک واقعی، واکشت مکرر بافت تراریخته روي یک محیط باززایی گیاه حاوي غلظت هاي بالاي آنتیبیوتیک - اسپکتینومایسین - انتخابی انجام شد ودر نهایت بر روي DNA استخراج شده از گیاهان توتون تراریخت واکنش زنجیره اي پلیمراز انجام و مقایسهي آن با گیاه شاهد به عمل آمد.
نتایج و بحث
تأیید ساخت سازهي ژنی حاوي دو ژن aadA و epsps تغییر یافتهي باکتریایی با استفاده از آنالیزهاي مولکولی پس از ساخت سازهي ژنی مورد نظر و به منظور کنترل آن در باکتريهاي نوترکیب از دو روش واکنش زنجیره اي پلیمراز و هضم آنزیمی استفاده شد. واکنش تکثیر با پرایمرهاي اختصاصی prochloF و EPS 2 حضور باند مورد انتظار را در تعدادي از کلونیهاي تراریخت شده نشان میدهد و علاوه بر آن هضم آنزیمی دوگانه با آنزیمهاي pstI و BglII صحت سازه مورد نظر را در کلونیهاي مذکور تأیید میکند - شکل. - 1 توالی پرایمرهاي مورد استفاده به صورت زیر میباشد :
شکل 1کنترل: ناقل همسانه سازي َشده حاوي هر دو ژن aadA و epsps جهشیافته با استفاده از PCR و هضم آنزیمی. الف: طرح شماتیک سازه ژنی ساخته شده و موقعیت پرایمرهاي مورد استفاده در تکثیر - PCR - و جایگاههاي برش آنزیمی. ب: محصول واکنش تکثیر با پرایمرهاي اختصاصی prochlo F و. - 2200 bp - EPS 2 1 تا -6 محصول واکنش PCR بر روي ناقلهاي نوترکیب و خالص. کلونیهاي 6 و 4 و 3 باند 2200 را نشان میدهند. -7 محصول واکنش PCR بر روي ناقلpKCZ معمولی - کنترل منفی - . -8 واکنش PCR بر روي ناقل pKCZ حاوي .epsps و فاقد aadA - قطعه مورد انتظار:-9 . - 1400bp کنترل منفی - بدون الگو - .
جکنترل: ناقل همسانه سازي َشده حاويهر دو ژن aadA و epsps جهش یافته با استفاده از هضم آنزیمی. 1 تا -3 هضم آنزیمی بر روي ناقلهاي نوترکیب - باند -4 . - 2200bp هضم آنزیمی بر روي ناقل pKCZ غیر نوترکیب -5 . - 900bp - هضم آنزیمی بر روي ناقل pKCZ حاوي epsps و فاقد ladder mix - fermentas - :M . - 1400bp - aadAِِ .DNA
تراریختی گیاه تنباکو با سازهي تهیه شده و به روش زیست پرتابی برگهاي استریل تنباکو به وسیله ذرات طلا ي پوشیده شده با سازهي ژنی و به کارگیري تفنگ ژنی طبق روش کاري استاندارد - BioRad - بمباران شد. به منظور رسیدن به یکنواختی - Homoplasmy - ، کلروپلاستها به طور متناوب در محیطهاي انتخابی حاوي اسپکتینومایسین قرارگرفتند. پس از حدود پنج ماه ریزنمونههاي بمباران شده شروع به باززایی کردند و در نهایت سه نمونهي گیاهی باززا شده از سه قطعهي برگی متفاوت به دست آمد گیاهان حاصل در محیط حاوي اسپکتینومایسین با غلظت500 mg/lit به طور کامل رشد کرده و ریشه زایی انجام دادند
