بخشی از مقاله
ژن فسفومانوز ايزومراز (pmi) به عنوان يک نشانگر انتخابي براي تراريختي توتون بواسطه آگروباکتريوم
چکيده
يک سيستم گزينشي مثبت با استفاده از ژن فسفومانوز ايزومراز براي تراريختي با واسطه Agrobacterium tomefaciens در توتون (Nicotiana tabacum) بکار گرفته شد. در مطالعه حاضر، غلظت هاي مختلف مانوز (g/l ٠، ١٠، ٢٠، ٣٠) در ترکيب با ساکارز (g/l ٠، ٥) براي تعيين کارايي سيستم گزينشي مبتني بر مانوز براي غربال گياهان تراريخته احتمالي در گياه توتون مورد ارزيابي قرار گرفت .
نتايج حاصل نشان داد که غلظت بهينه مانوز براي گزينش سلول هاي تراريخته g/l ٢٠ مانوز بدون ساکارز بود، زيرا در اين غلظت حداقل رشد براي سلول هاي غير تراريخته در مقايسه با سلول هاي تراريخته با ژن pmi مشاهده شد. وضعيت تراريختي گياهچه هاي گزينش شده با استفاده از آناليز PCR تاييد شد. نتايج حاصل نشان داد که سيستم گزينشي مانوز در گياه توتون با کارايي تراريختي ٢١/٧٥% و کارايي گزينش ٩٤/٥٦% بسيار کارآمد است .
کلمات کليدي : توتون ، فسفو مانوز ايزومراز، pmi، کارايي تراريختي
مقدمه
تکنولوژي تراريختي گياهي معمولاً متکي بر استفاده از يک ژن نشانگر انتخابي براي تسهيل شناسايي و انتخاب سلول هاي تراريخته از سلول هاي غير تراريخته مي باشد. اخيراً سيستم هاي گزينشي جايگزين براي بازيابي گياهان تراريخته با استفاده از ژن هاي نشانگر مثبت به جاي استفاده از ترکيبات سمي در محيط هاي کشت با موفقيت توسعه يافته اند (٣). سيستم هاي گزينشي مثبت با استفاده از مانوز، گزيلوز و يا داکسي گلوکز به عنوان عامل گزينشي موثر در برخي از محصولات شناخته شده اند (٩). ژن pmi رمز کننده آنزيم فسفومانوز ايزومراز (PMI) است که در باکتري E. coli، مخمر و پستانداران (از جمله انسان ) وجود دارد، اما وجود آن فقط در تعداد کمي از گونه هاي گياهي مانند سويا و چند لگوم ديگر نيز گزارش شده است (٩). فعاليت PMI در کشت سوسپانسيون سلولي Nicotiana tabacum و همچنين در برگ هاي توتون نسبتا پايين است که منجر به متابوليسم آهسته مانوز مي شود (٢). در سلول هاي تراريخته مانوز توسط يک هگزوکيناز به مانوز ٦-فسفات فسفريله مي شود که حاصل آن توليد فسفات و ATP و در نتيجه توليد انرژي مورد نياز براي فعاليت هاي مهم سلولي از جمله تقسيم سلولي مي باشد. چنانچه سلول هاي گياه بر روي محيط کشتي که تنها منبع کربن آن مانوز است کشت شوند سلول هاي تراريخت نشده قادر به رشد و تکثير بر روي اين محيط نخواهند بود. سيستم گزينشي مانوز/PMI به طور موفقيت آميزي در باززايي گياهان تراريخته از محصولات مهم از جمله چغندرقند، گندم ، ذرت ، برنج ، نيشکر، کتان ، گوجه فرنگي ، سيب زميني ، مرکبات ، سورگوم و ارکيده مورد استفاده قرار گرفته است (٩). طبق بررسي هاي انجام گرفته ، PMI به راحتي در دستگاه گوارش ساختگي هضم شده ، هيچ گونه اثرات مضر در آزمايشات سميت خوراکي موش نشان نداده است ، هيچ تغيير قابل تشخيص بيوشيمايي در مسير مرتبط با مانوز ايجاد نمي کند، فاقد بسياري از نشانه هاي مرتبط با حساسيت هاي خوراکي است و بنابراين به عنوان يک پروتئين نشانگر ايده آل براي تراريختي گياهان در نظر گرفته شده است (٧).
توتون يک سيستم مدل براي مطالعات کشت بافت و مهندسي ژنتيک بوده وهم چنين منشا بسياري از اکتشافات در زمينه کشت بافت و سلول گياهي و همچنين زيست شناسي مولکولي ناشي از آزمايش بر روي گياه توتون مي باشد. به طور معمول از اين گياه در مطالعات مربوط به توليد پروتئين هاي نوترکيب ، آنتي بادي ها و مواد شيميايي خاص براي کاربرد در پزشکي و صنعت استفاده مي شود
(٥). اخيرا باهاريا و همکاران (١) در مطالعه خود از توتون به عنوان يک گياه مدل براي بررسي اثر بخشي سيستم گزينشي مبتني بر مانوز در ترانسفورماسيون به روش ريزپرتابي استفاده کردند. بر اساس منابع علمي در دسترس ، استفاده از اين سيستم گزينشي در تراريختي توتون بواسطه آگروباکتريوم گزارش نشده است . در اين تحقيق کارآيي سيستم گزينشي مبنتي بر مانوز در تراريختي بواسطه آگروباکتريوم در گياه توتون (Nicotiana tabacum) مورد بررسي قرار گرفت .
مواد و روش ها
تراريختي آگروباکتري با پلاسميد نوترکيب ،در اين مطالعه سازه pBCAMBIA-PMI حاوي ژن pmi از منشا باکتري E. coli به روش ذوب و انجماد به باکتري Agrobacterium tomefaciens سويه LBA٤٤٠٤ انتقال يافت . حضور سازه مورد نظر در کلوني هاي حاصل از تراريختي آگروباکتريوم به روش Colony PCR با آغازگرهاي اختصاصي ژن pmi تاييد گرديد.
تعيين حساسيت به مانوز براي باززايي شاخساره ،حساسيت ريزنمونه ها نسبت به مانوز با کشت ريزنمونه هاي تراريخت نشده در محيط کشت باززايي حاوي غلظت هاي مختلف مانوز (g/l ٠، ١٠، ٢٠، ٣٠) در ترکيب با ساکارز (g/l ٠، ٥) تعيين شد. براي هر ترکيب مانوز/ساکارز از سه تکرار و در هر تکرار از ٩ ريزنمونه استفاده شد. پس از سه هفته ، درصد ريزنمونه هاي باززا شده ، ميانگين تعداد شاخساره هاي توليد شده در هر تيمار و ميانگين طول شاخساره ها اندازه گيري شد. داده هاي اين آزمايش ها در قالب طرح کاملا تصادفي آناليز شد و پس از تست نرمال بودن داده ها تبديل جذري آنها انجام شد. براي تجزيه و تحليل آماري داده ها از نرم افزار SAS ٩.١ استفاده شد و مقايسه ميانگين داده ها با استفاده از آزمون چند دامنه اي دانکن در سطح احتمال ١% انجام شد.
تراريختي ، ريزنمونه هاي برگ به واسطه آگروباکتري حاوي پلاسميد نوترکيب جهت انتقال ژن از ريزنمونه هاي برگي جوان و چهار هفته اي گياه توتون استفاده شد. باکتري Agrobacterium tomefaciens سويه LBA٤٤٠٤ حاوي سازه مورد نظر به مدت يک شبانه روز در دماي ٢٨ درجه سانتي گراد در محيط کشت مايع LB حاوي mg/l ٥٠ ريفامپسين و mg/l ٥٠ کانامايسين رشد کرد. ريزنمونه ها به مدت ١٠ دقيقه در سوسپانسيون باکتري غوطه ور شدند، پس از خشک کردن نسبي ريزنمونه ها بر روي کاغذ صافي استريل ، ريزنمونه ها به محيط کشت هم کشت شامل محيط MS (٦) حاوي سيناميک اسيد (mg/l ١٥٠)، mg/l( BAP ١)، mg/l( IBA ٠,١)، مانوز (g/l ٢٠) و آگار (g/l ٧) منتقل شده و در اتاق رشد با دماي C̊ ٢٥ در شرايط نور کم قرار گرفتند. ٤ روز پس از هم کشتي ، ريزنمونه ها در محيط شستشو شامل محيط MS٢١ حاوي mg/l ٥٠٠ سفوتاکسيم شستشو داده شده و در محيط کشت انتخابي شامل محيط کشت MS حاوي mg/l( BAP ١)، mg/l( IBA ٠,١)، مانوز (g/l ٢٠) و آگار (g/l ٧) کشت شدند. پس از باززايي ريزنمونه ها، گياهچه هاي ٣-٢ ميلي متري از ريزنمونه جدا شده و براي رشد بيشتر در محيط کشت پايه MS بدون تنظيم کننده رشد کشت شدند.
ريشه زايي گياهچه ها در همان محيط انجام شد. تمام کشت ها در اتاق رشد تحت شرايط کنترل شده با تناوب نوري ١٦ ساعت روشنايي و ٨ ساعت تاريکي با ميزان نور ١-s٢-μEm١٦٠ و دماي C° ٢±٢٤ قرار داده شدند.
تاييد حضور ژن pmi درگياهان با انجام واکنش زنجيره اي پليمراز (PCR)، براي آناليز PCR،DNA ژنومي از برگ هاي تازه گياهچه هاي تراريخته احتمالي به روش دلاپورتا و همکاران (١٩٩٣) استخراج شد. به منظور شناسايي گياهان تراريخته احتمالي ، آناليز
PCR براي نمونه هاي DNA ژنومي با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي ژن pmi براي تکثير يک قطعه bp ٨٣٦ استفاده شد. واکنش تکثير در دستگاه ترموسايکلر با دماي اتصال C° ٥٢ و طي ٣٥ چرخه انجام شد. کارايي گزينش (SE) به صورت تعداد گياهچه هاي تراريخته در تعداد کل گياهچه هاي باززا شده محاسبه گرديد و به صورت درصد بيان شد. کارايي تراريختي (TE) به صورت تعداد گياهچه هاي تراريخته باززا شده در تعداد کل ريزنمونه ها محاسبه شده و به صورت درصد بيان شد.
نتايج و بحث
تعيين غلظت مناسب مانوز براي انتخاب گياهچه هاي تراريخته توتون
نه ترکيب مختلف مانوز/ساکارز در محيط باززايي براي ارزيابي تاثير مانوز بر روي اندام زايي در ريزنمونه هاي برگي توتون مورد استفاده قرار گرفت . تيمار مانوز به طور معني داري باززايي و طول شاخساره ها در ريزنمونه هاي برگ توتون را تحت تاثير قرار داد.
هيچ گونه باززايي در محيط کشت عاري از منبع کربن مشاهده نشد. اگرچه با افزايش غلظت مانوز تعداد و طول شاخساره ها به طور معني داري کاهش يافت ، با اين حال افزودن g/l ٥ ساکارز در تمام غلظت هاي مانوز باعث افزايش تعداد و طول شاخساره ها شد (شکل ١). بنابراين ، اين نتايج نشان مي دهد که گياهچه هاي تراريخته توتون مي توانند در محيط حاوي غلظت هاي بالاي مانوز مورد انتخاب قرار گيرند (شکل ٢). در مطالعه اي ديگر، موثر بودن غلظت g/l ٣٠ مانوز در بازدارندگي از تشکيل شاخساره در کالوس هاي حاصل از ريزنمونه هاي برگ تراريخت نشده توتون نيز گزارش شد (١). نتايج مشابهي در مطالعه بر روي مرکبات (٣) و ارکيد (١٠) به دست آمد.
شکل ١.
تاثير غلظت هاي مختلف مانوز/ساکارز بر اندام زايي از ريزنمونه هاي برگ در گياه توتون (N. tabacum).A ) ميانگين تعداد شاخساره هاي تشکيل شده در ريزنمونه هاي برگي تراريخت نشده سه هفته بعد از کشت ، B) ميانگين طول شاخساره هاي تشکيل شده در ريزنمونه هاي برگي تراريخت نشده سه هفته بعد از کشت . ستون ها، SE ± ميانگين صفت را نشان مي دهند. اعداد داراي حروف غير مشترک از نظر آماري داراي اختلاف معني دار (٠/٠١ ˂ P) بر اساس آزمون چند
دامنه اي دانکن مي باشند.
شکل ٢. باززايي جوانه هاي نابه جاي القا شده بر روي ريزنمونه هاي برگ توتون تراريخته با ژن pmi بواسطه Agrobacterium tumefaciens در محيط گزينش (محيط MS پايه حاوي g/l ٢٠ مانوز). A) القاي جوانه هاي نابه جا (علامت هاي پيکان ) در ريزنمونه برگ کشت شده در محيط گزينش ، B) رشد گياهچه هاي تراريخته بالقوه در محيط گزينش ، C) کشت ريزنمونه بدون انجام عمليات تراريختي در محيط گزينش (جوانه ها قادر به رشد نبودند). .
تاييد تراريختي توتون با استفاده از آناليز PCR
حضور ترانسژن در گياهچه هاي گزيش شده در حضور مانوز توسط واکنش PCR مورد ارزيابي قرار گرفت . واکنش PCR با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي pmi وجود قطعه bp ٨٣٦ را نشان داد که برابر با اندازه مورد انتظار قطعه تکثير شده در کنترل مثبت (پلاسميد حاوي ترانسژن مورد استفاده در تراريختي ) بود. در گياهان شاهد هيچ گونه تکثيري مشاهده نشد. در برخي از گياهچه هاي گزيش شده نيز قطعه مورد نظر مشاهده نشد (شکل ٣)، که مي تواند به دليل کيفيت نامناسب در نمونه DNA يا مشکل در واکنش PCR باشد و نياز به تکرار PCR در اين نمونه ها دارد. بر اساس نتايج حاصل از آناليز PCR، کارايي تراريختي پس از گزينش در محيط کشت انتخابي حاوي g/l ٢٠ مانوز بدون ساکارز ٢١/٧٥% و کارايي گزينش ٩٤/٥٦% بدست آمد. اين نتايج نشان دهنده کارآمدي بالاي سيستم گزينشي PMI در مقايسه با سيستم هاي گزينشي مبتني بر آنتي بيوتيک ها مانند کانامايسين است (١ و ١٠). علاوه بر عامل انتخابي مورد استفاده در محيط گزينش ، کارايي تراريختي بستگي به ژنوتيپ گياه ، نوع سازه پلاسميدي ، نوع ريزنمونه و نحوه باززايي دارد (٨).
مطابق با نتايج اين تحقيق ، در مطالعات ديگر در گياهان مختلف نيز کارآمدي اين سيستم گزينشي ثابت شده است ، از جمله ٣١% کارايي تراريختي در ذرت ، ٢٥% در گندم ، ٢٤% در سيب و بيش از ٥٣% در سيب زميني گزارش شده است (٤).
