بخشی از مقاله
چکیده
به طور سنتی بشر از هزاران سال پیش از قارچها برای تولید محصولات صنعتی مختلف استفاده کرده است. اما بسیاری ازقارچها هر ساله خسارتهای بسیاری به جانوران و گیاهان وارد کرده و مهمترین عوامل کاهش محصولات کشاورزی محسوب میشوند.
به همین دلیل محققان به دنبال راههایی برای استفادهی بیشتر از فواید قارچها و نیز از بین بردن مضرات قارچهای بیماریزا بودهاند. پیشرفت روشهای موثر برای دستکاری ژنتیکی و مهندسی ژنتیک این موجودات در طی دو دههی گذشته منجر به درک فرآیندهای بیولوژیکی اساسی شده و به محققان امکان داده تا بتوانند با دستکاری ژنتیکی در قارچها از مزایای آن ها استفاده کرده و در مواردی اثرات زیانبار آنها را از بین برند. در زیست شناسی مولکولی، جذب و دریافت دیانای از محیط خارج توسط سلولها را ترانسفورماسیون گویند.
اولین گزارش رسمی از ترانسفورماسیون از یک گونهی قارچی در Neurospora crassa صورت گرفت. در حال حاضر بیشتر گروههای قارچی نیز قابل ترانسفورم کردن میباشند. ترانسفورماسیون در قارچها به روشهای مختلفی از قبیل ترانسفورم کردن پروتوپلاست با پلی اتیلن گلایکول، الکتروپوراسیون، ترانسفورم کردن با واسطهی آگروباکتریوم، ریز تزریقی و بمباران ذرهای صرت میگیرد. ترانسفورماسیون یک بخش ضروری از مطالعات مدرن قارچها بوده و اهمیت بالایی درکاربرد تعداد زیادی از گونههای قارچی در بیوتکنولوژی دارد.
-1 مقدمه
اساس روشهای دستکاری ژنتیکی موجودات از جمله قارچها تولید دی-انای نوترکیب است.؛ بنابراین تولید دیانای نوترکیب اساس ترانسفورماسیون است. ترانسفورماسیون ژنتیکی شامل معرفی، تلفیق و بیان ژنهای خارجی در سلول پذیرنده است. پیشرفتهای موجود در زمینهی دیانای نوترکیب، توانایی دستکاری ژنوم موجودات را امکانپذیر ساخته است.
این روشها به محققان امکان داد تا ژنهای مورد نظر را از هر موجودی و از جمله قارچها جدا و تکثیر کنند تا مقادیر زیادی از این ژنها را به دست آورده و خصوصیات و وظایف آنها را مورد بررسی قرار دهند
بیشتر باکتریها قادر به جذب دیانای از محیطی که در آن رشد میکنند هستند. گونههای قارچی و مخمرها در شرایط طبیعی قادر به جذب مقدار محدودی دیانای میباشند؛ ولی میتوان به صورت مصنوعی دیایای خارجی را به آنها وارد نمود. اولین گزارش رسمی از ترانسفورماسیون از یک گونهی قارچی در سال 1973 با Neurospora crassa صورت گرفت . - 3 - در حال حاضر بیشتر گروههای قارچی شامل زیگومیستها، آسکومیستها، بازیدیومیستها و حتی شبه قارچهای اوومیستی نیز قابل ترانسفورم کردن میباشند
-2روشهای ترانسفورم کردن - انتقال ژن - در قارچها
ترانسفورماسیون در قارچها به روشهای مختلفی انجام میشود. این روشها شامل ترانسفورم کردن پروتوپلاست با پلی اتیلن گلایکول و کلرید کلسیم، الکتروپوراسیون، ترانسفورم کردن با واسطهی آگروباکتریوم، ریز تزریقی و بمباران ذرهای است. در این بررسی به روشهای پرکاربرد در ترانسفورم کردن قارچها اشاره میشود
-ترانسفورم کردن با پروتوپلاست در حضور نمک و PEG
چون سلولهای قارچها دارای دیوارهی سلولی میباشند و دیواره آنها حاوی کیتین، پپتیدوگلوکان یا کیتوزان است، بنابراین سلولها قادر به جذب دیانای نوترکیب نیستند. ولی اگر با آنزیمهای تخریب کننده، دیواره سلولی از بین رود، پروتوپلاست به دست میآید. پروتوپلاست قادر به جذب دیانای نوترکیب و همچنین قادر به رشد در محیط مناسب میباشد. برای آماده سازی پروتوپلاستها با قابلیت ترانسفورم شدن، انتخاب آنزیمهای تخریب کننده دیواره سلولی بسیار حیاتی است
از این روش برای ترانسفورم کردن بسیاری از قارچها برای مثال lagopus, و گونههای مخمر و آسپرژیلوس استفاده شده است. تولید پروتوپلاست، چندان دشوار نمیباشد اما نیاز به مراقبتهای زیادی دارد. زمان و مقدار آنزیم مورد استفاده بسیار مهم هستند. به دلیل مشکلات موجود، محققان بیشتر تمایل به استفاده از روشهای جایگزین پروتوپلاست دارند
-ترانسفورم کردن با واسطهی Agrobacterium tumefaciens
این روش نیز به طور گسترده برای برای انتقال ژنهای زیادی به گونه-های قارچی مورد استفاده قرار گرفته است. از این روش به طور موثر برای ترانسفورم کردن مخمرها و قارچهای گیاهی استفاده شده است. همچنین در ترانسفورم کردن قارچ رشتهای Chaetomium globosum با کارایی 60-180 ترانسفورم شده در 107 اسپور و F. moniliform و Gliocladium roseum استفاده شده است
-ترانسفورم کردن به روش ایجاد منافذ در سلول با جریان الکتریسیته - الکتروپوراسیون -
همانطور که قبلا ذکر شد در قارچها مهمترین مانع موجود جهت جذب دیانای خارجی توسط سلولها وجود دیواره سلولی در ساختار آنهاست. در جانوران که سلولها فاقد دیواره هستند به راحتی ترانسفورم میشوند اما برای قارچها باید دیواره سلولی برداشته شود. که از آنزیمهای تخریب کننده دیواره سلولی مخمر و قارچها جهت به دست آوردن پروتوپلاست استفاده میشود. پروتوپلاست میتواند دیانای را جذب کند اما برای تحریک به جذب بهتر آن میتوان از روش الکتروپوراسیون استفاده نمود. در این روش سلولها تحت تاثیر یک جریان الکتریکی قرار گرفته تا منافذ موقتی در غشای سلول ایجاد شود و دیانای به این صورت وارد سلول میشود. پس از ترانسفورم کردن سلولها را شسته و دیواره سلولی دوباره تشکیل میشود
-5مارکرهای انتخاب سلولهای ترانسفورم شده در قارچها
جهت انتخاب سلولهای ترانسفورم شده در قارچها از دو روش مارکرهای انتخاب غالب و جهشیافتههای آگسوتروفی استفاده میشود. در مارکرهای مقاومت به دارو جداسازی سلولهای ترانسفورم شده، بر اساس مقاومت به یک آنتیبیوتیک یا ماده خاص صورت میگیرد. آنتی بیوتیکهایی که برای انتخاب سلولهای نوترکیب در قارچها استفاده میشوند شامل هیگرومایسین B، نئومایسین، الیگومایسین و بنومیل میباشند. بیشترین ژنی که تاکنون برای بسیاری از قارچها مثل بازیدیومیستها و از جمله قارچهای رشتهای استفاده شده ژن مقاومت به هیگرومایسین است. اما مشکل این روش این است که بسیاری از قارچها به آنتی بیوتیک حساسیت نشان نداده و مقاوم هستند؛ بنابراین در بیشتر مطالعات ترانسفورماسیون قارچی از جهش یافته های آگسوتروفی استفاده شده است
به این صورت که ژنهای تیپ وحشی خاصی با توانایی مکملشدن با موتانتهای آکسوتروفی به عنوان نشانگرهای قابل انتخاب مورد استفاده قرار میگیرند. در این روش ابتدا جهش یافتههای آکسوتروفی ایجاد میشوند. سپس جهشیافتهها با ژن مورد هدف از استرینهای تیپ وحشی ترانسفورم میشوند. ژن گرفته شده از تیپ وحشی توانایی تولید یک آنزیم یا اسید آمینه خاصی را داشته و لذا در محیط کشت حداقل قادر به رشد است. ولی جهش یافتهی این ژن فاقد این توانایی هستند بنابراین در محیط کشت حداقل تنها جهش یافتههای حاوی ژن نوترکیب قادر به رشد میباشند.
به این طریق میتوان نوترکیب-ها را انتخاب نمود. متداولترین مکملهای آکسوتروفی که در قارچ ها برای این روش استفاده شده شامل ژنهای آلفا ایزوپروپیل مالات دهیدروژناز LeuA - یا - leu1 و مونوفسفات--5 اروتیدین دکربوکسیلاز pyrG - یا - pyr4 هستند که به ترتیب مکملهای آکسوتروفی لوسین و یوراسیل میباشند. این روش به طور گسترده برای انتخاب ترانسفورم شده ها در بسیاری از قارچهای رشتهای، مخمرها و زیگومیستها استفاده شده است. اما مشکل این روش نیز نیاز به تولید جهشیافتههای آگسوتروفی مناسب است
-6ترانسفورماسیون درزیگومیستها
قارچهای گروه زیگومیستها به خصوص اعضای راستههای Mucorales و Mortierellales از جنبههای مختلف بیولوژیکی، بیوتکنولوژی، پزشکی و کشاورزی بسیار مهم هستند. آنها به عنوان موجودات مدل در بررسی بسیاری از سوالات بیولوژیکی موجود، مثلا دوشکلی ریخت شناسی، بیوسنتز کارتنوئیدها و تولید متابولیتهای مختلف استفاده شدهاند.
به عنوان قارچهای فرصت طلب سبب آلودگی بسیاری از بیماران شده و تحت عنوان بیماریهای Zycomycoses شناخته میشوند. به دلیل مشکلات موجود در زمینه تشخیص و عدم قابلیت درمان، نرخ مرگ و میر بالایی در بیماران آلوده به این قارچها مشاهده شده است. گونههایی از جنسهای Mucor، Rhizopus و Gibertella به خصوص در کشاورزی در زمینه خسارتهای پس از برداشت محصولات بسیار مهم هستند.
در سالها اخیر مطالعات زیادی روی جنبههای مولکولی و ژنتیک بیماریزایی این قارچها انجام گرفته است. قارچهای این گروه به عنوان تولیدکنندگان اصلی بسیاری از آنزیمهای هیدرولیتیکی، اسیدهای ارگانیک و دیگر متابولیتهایی نظیر کارتنوئیدها و اسیدهای چرب غیر اشباع محسوب میشوند. بیشترین گونههای مورد استفاده شامل R. oryzae است که در تولید اسید لاکتیک مورد استفاده قرار میگیرد..
گونهی Blakselea trispora نیز یک منبع صنعتی بتاکاروتن و لیکوپن میباشد. برخی از زیگومیستهای دیگر نظیر Rhizopus oligosporus به عنوان تخمیر کنندههای غذایی شناخته میشوند. واضح است که پیشرفتهای بیولوژیکی و بیوتکنولوژی و نیز مطالعات بیماریزایی این گروه مهم از قارچها به روشهای کاربردی و ابزارهای مفید آنالیز و دستکاری ژنها مثل انتخاب روشهای مناسب ترانسفورم کردن نیازمند است
در طول چندین دههی گذشته، مطالعات ژنتیک مولکولی روی این گروه از قارچها به طور گستردهای در تمام زمینههای ذکر شده در بالا توسعه یافته است. اخیرا توالی کل ژنوم سه قارچ مدل زیگومیستی R. oryzae - ، P. blakesleeanus و - M. circinelloides کامل شده است. که این کشف، بررسی و مطالعهی آنها را تسهیل کرده است . - 12 - به طور سنتی بیشتر روشهای مرسوم برای ترانسفورم کردن زیگومیستها، ترانسفورماسیون پروتوپلاست با واسطهی پلی اتیلن گلایکول میباشد.
جهت تولید پروتوپلاست، بر اساس ترکیب دیوارهی سلولی زیگومیستها، ترکیبات آنزیمهای تخریب کنندهی دیوارهی سلولی شامل کیتین و کیتوزان است. برای تشکیل پروتوپلاست، اسپورها بسته به گونه یا استرین به مدت سه تا شش ساعت در یک محیط مایع حاوی این آنزیمها نگهداری میشوند. سپس اسپورها روی محیط کشت جامد به مدت 20 ساعت در دمای مناسب نگهداری میشوند. کلنیهای تشکیل شده برای ترانسفورماسیون انتخاب میشوند
اخیرا ترانسفورم کردن قارچهای زیگومیستی با واسطهیA. tumefaciens بسیار مورد توجه قرار گرفته است و در گونههای R. oryzae، M. circinelloides و B. lamprosora به کار گرفته شده است.. در این روش قارچ مورد نظر با یک استرین از باکتری A. tumafaciens با پلاسمید Ti نوترکیب به طور همزمان کشت داده میشوند. روش کار برای گونههای مختلف قارچی متفاوت است و یک ترانسفورماسیون موفقیت آمیز به عوامل مختلفی از جمله مقدار اینوکلوم قارچ، نوع بافت مورد استفاده - پروتوپلاست، اسپور و ... - و دمای مناسب کشت بستگی دارد
در روش ATMT در زیگومیستها، استفاده از پروتوپلاست سلولهای قارچی گزینهی بسیار مناسبتری است. همچنین در برخی موارد، کشت همزمان پروتوپلاست یا اسپورهای جوانه زده قارچ با باکتری در محیط کشت مایع اثر بیشتری در ترانسفورم شدن بهتر و بیشتر نسبت به محیط کشت جامد دارد. در این روش همچنین برقراری تعادل مناسب رشد قارچ و باکتری، دمای رشد و طول دورهی کشت برای یک ترانسفورم کردن موفق و کارا بسیار ضروری میباشند
ترانسفورم کردن با واسطهی آگروباکتریوم مزیت های زیادی دارد. برای مثال این روش یک ابزار طبیعی برای انتقال ژنها است و در بین کسانی که روش های طبیعی را ترجیح می دهند از مقبولیت بیشتری برخوردار می باشد. آگروباکتریوم قادر است که قطعات بزرگ دیانای با کارایی زیاد را به قارچ انتقال دهد. همچنین ژن انتقال یافته نسبتا پایدار است
از روشهای دیگری نیز جهت ترانسفورم کردن زیگومیستها استفاده شده است. برای مثال الکتروپوراسیون پروتوپلاستها نیز به ندرت برای زیگومیستها کاربرد داشته ولی این روش به طور موفقیت آمیزی برای A. gluca استفاده شده است. از دیگر روشهای موجود، روش بمباران ذرهای اسپورانژیوسپورهاست که برای جنسهای مختلف زیگومیستها نظیر Absidia، Mortierella وRhizopus استفاده شده است.
در این روش، دیانای مورد نظر را با ذرات فلزی با سرعت زیاد به داخل سلول وارد میکنند و در نتیجه ادغام دیانای با کروموزوم سلول صورت میگیرد. از طریق این روش میتوان دیانای را به طور مستقیم وارد سلولهای حاوی دیواره نمود. در واقع از مزیت اصلی این روش تولید سلولهای ترانسفورم شده بدون نیاز به تشکیل پروتوپلاست است
-7ترانسفورم کردن قارچهای رشته ای
قارچهای رشته ای کاربردهای صنعتی بیشماری داشته که مزایای زیادی برای بشر دارند. با این وجود، بیماریهای گیاهی قارچی با خسارتهای اقتصادی بسیار مهمی را نیز ایجاد میکنند. پیشرفت روشهای موثر برای مهندسی ژنتیک این موجودات در طی دو دههی گذشته منجر به درک فرآیندهای بیولوژیکی اساسی قارچهای رشتهای شده است
ترانسفورمکردن در این قارچها نیز با روش معمول آماده سازی پروتوپلاست از سلولها با استفاده از آنزیمهای تخریب کننده دیوارهی سلولی انجام میشود. مخلوط آنزیمی که برای این قارچها در بازار عرضه شده Novozyme 234 است. سپس پروتوپلاستها در محیط اسمزی پایدار با کلرید سدیم، سولفات منیزیم، مانیتول یا سوربیتول قرار می-گیرند. جذب دیانای توسط پروتوپلاستها در حضور یونهای کلسیم و غلظتهای بالای پلی اتیلن گلایکول انجام میگیرد. همچنین روش الکتروپوراسیون نیز برای کنیدیهای قارچ Aspergillus nidulans استفاده شده است
روش ترانسفورم کردن با واسطهی پلی اتیلن گلایکول بیشترین روش مورد استفاده برای مطالعات قارچهای رشتهای تاکنون بوده است. این روش برای ترانسفورم کردن Stagonospora nodurun - بیمارگر گندم - و قارچها ناقص مورد استفاده قرار گرفته است. علاوه براین روش ترانسفورم کردن با A. tumefaciens نیز به طور گسترده ای در مطالعهی قارچهای رشتهای به خصوص جنس Chaetomium globosum استفاده شده است برای انتخاب سلول-های ترانسفورم شده تاکنون مارکرهای انتخاب زیادی مورد استفاده قرار میگیرد.
