بخشی از مقاله
چکیده:
مقدمه:آسپرژیلوسها گروهی از قارچها هستند که دارای قدرت تکثیری ورشد فراوان میباشند و بهعنوان بخشی از فلور قارچی اکثر مکانها شناخته میشوند،از بین آسپرژیلوسها تعدادی از گونهها دارای قابلیت توکسین زایی هستند و میتوانند در انسان و جانوران ایجاد بیماری نمایند.
اهداف: در این پژوهش کلیه جدایه های آسپرژیلوس بر روی مواد غذای باهدف شناسایی و توکسین زایی مورد برسی قرارگرفتهاند.
روش تحقیق: جهت انجام این پژوهش از 30 مرغداری حومه خرمآباد 180نمونه تهیه گردید و پس از انتقال به آزمایشگاه وکشت، خالص سازی انجام گرفت، سپس شناسایی جدایهها با استفاده از کلیدهای معتبر قارچشناسی صورت پذیرفت و استخراج توکسین گونهها نیز بر روی بستره ذرت انجام گرفت، همچنین تعیین توکسینزا بودن گونهها به 2روش نارگیل آگار و TLC صورت پذیرفت.
خلاصه نتایج :در این پژوهش چندین گونه Aspergillus شامل گونههای A.ochraceus, A.parasitichus, A. flavus A.niger, A.alliaceus, و A.tereus شناسایی گردید. که گونه A. flavus با 69جدایه - 0/038 - بیشترین فراوانی را به خود اختصاص داد و گونه A.tereus با 7 جدایه - 3/88 - از کمترین فراوانی برخوردار بود.درنهایت مشخص گردید تمامی گونهها بهاستثنای جدایه های مربوط به گونه A.alliaceus برروی جیره غذایی طیور قابلیت توکسین زایی دارند.اطلاع از توکسین زا بودن این قارچها بر روی جیره غذایی طیور و نحوه توکسین زایی این قارچها میتواند در مدیریت و پیشگیری از آلودگی توسط این قارچها راه گشا باشد.
مقدمه:
وجود برخی از قارچها در جیره غذای دام و طیور طبیعی بوده و درصورتیکه رشد بیرویه نداشته باشند، خطرات بهداشتی به دنبال ندارد ولی برخی از قارچها که موسوم به قارچهای توکسینزا میباشند، از اهمیت ویژهای برخوردارند. مایکوتوکسینها متابولیتهای ثانویه تولیدشده بهوسیله برخی از قارچهای رشتهای هستند که محصولات کشاورزی را آلوده میکنند. آنها برای انسان و حیوانات سمی هستند و سبب کاهش معنیداری در بازده محصول و زیانهای اقتصادی میشوند.گزارشهای گستردهای از وقوع خسارات قارچی در کشورهای مختلف وجود دارد.
این متابولیتها توسط گونههای از جنس fusarium, Alternaria, Aspergillus, penicillium و Claviceps تحت شرایط ویژهای ازلحاظ دما،رطوبت و اکسیژن تولید میشوند و برای فعالیتهای سلول ضروری نیستند.تاکنون اثرات بیولوژیکی فراوانی را برای سموم قارچی بهویژه آفلاتوکسینها ذکر کردهاند ازجمله میتوان به اثرات سمیت حاد و مزمن،ا ثرات سمی بر روی سلولها - Cytotoxicity - ، سمیت عصبی - Neurotoxicity - ، سرکوب فعالیت سیستم ایمنی، ناقصالخلقهزایی - Teratogenicity - ، جهشزایی - Mutagenicity - ، سرطانزایی اشاره نمود
این متابولیتها باعث صدمه به کبد انسان و بیشتر حیوانات آزمایشگاهی موردمطالعه گردیده است.مصرف غذاهای آلودهشده به مایکوتوکسینها با موارد چندی از مسمومیت آدمی همراه بوده است، و حتی مسمومیت با مایکوتوکسین بعضی مواقع باعث مرگ شده است .[1] بادامزمینی، پسته، گندم، برنج، ذرت، بادام و انجیر از مهمترین میزبانان این قارچ هستند و بهعنوان مناسبترین بستر طبیعی برای رشد قارچهای آفلاتوکسینزا در جهان شناختهشدهاند. تاکنون چندین نوع آفلاتوکسین شناساییشده است که از بین آنها آفلاتوکسین B1,B2,G1,G2 از بیشترین اهمیت برخوردار هستند
از میان انواع آفلاتوکسینهای شناختهشده، افلاتوکسینB1 توسط آژانس بینالمللی عوامل سرطانزا در گروه A قرارگرفته است تحقیق بر روی سرطان و در این میان سمیت و سرطانزایی افلاتوکسین B1 بیش از انواع دیگر گزارششده است، آلودگی خوراک دام و طیور به قارچها و به دنبال آن افلاتوکسینها، علاوه بر ایجاد زیانهای اقتصادی، مصرفکنندگان مواد غذایی با منشأ دامی را نیز به مخاطره میاندازد. لذا ردیابی و ارزیابی میزان افلاتوکسینها در خوراک دام و مواد غذایی و مقایسه آن با مقادیر استاندارد بهمنظور پیشآگاهی، ارائه پیشنهادها و اقدامات بهمنظور پیشگیری از افلاتوکسیکوزیس در دام و انسان، ضروری به نظر میرسد . تاکنون مطالعات متعددی در خصوص بررسی حضور افلاتوکسینها در خوراک دام در ایران و بسیاری از کشورهای جهان صورت گرفته است
نشانههای بالینی مسمومیت با آفلاتوکسین شامل:جراحات کالبدگشایی، ضایعات کالبدگشایی،ضایعات آسیبشناسی بافتی، و همچنین اثرات ایجادشده بر روی شاخصهای تولیدی گلههای طیور در موارد وقوع تجربی و طبیعی وقوع افلاتوکسیکوزیس در جوجههای گوشتی در سرتاسر دنیا گذارش شده است.[6] اندام اصلی موردحمله آفلاتوکسینها کبد است و در انسان موجب اختلالهای شدید کبدی میشوند . در حیوانها نیز موجب اختلال در دستگاه گوارش، جلوگیری از فعالیت سیستم ایمنی، کاهش تولیدمثل، افزایش ضریب تبدیل غذا، کاهش تولید شیر و تخممرغ، کمخونی ،یرقان کاهش رشد میشود .[7] با توجه به اهمیت وجود گونههای توکسین زا بر روی مواد غذایی و جیرههای غذایی طیور مطالعه در خصوص شناخت گونههای توکسینزا و نحوه توکسین زایی آنها ضروری به نظر میرسد.
مواد و روشها:
بهمنظور شناسایی جدایههای قارچ آسپرژیلوس موجود در مرغداریهای شهرستان خرمآباد طی سالهای 93-92 از 30 مرغداری فعال واقع در قسمتهای مختلف حومه این شهرستان نمونهبرداری صورت گرفت. نمونههای گرفتهشده مواد مختلفی ازجمله کلیه جیرههای غذای مورداستفاده طیور شامل : پیش دان، میان دان، پس دان، ذرت، سویا را تشکیل میدادند از این تعداد مرغداری 150 نمونه جدا گردید و در درون کیسههای پلاستیکی در یخچال با دمای 4 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. سپس از محیط کشت سیبزمینی دکستروز آگار - PDA - جهت کشت و جداسازی اولیه قارچهای موجود از روی نمونهها استفاده گردید نمونههای حاصل به مدت 24تا48 ساعت در انکوباتور با دمای 25 درجه سانتیگراد قرار داده شدند، سپس جهت خالصسازی قارچها از پر گنههای تازه رشد یافته زیر کشت تهیه گردید.
الف- خالصسازی قارچها
بهمنظور خالصسازی جدایههایه قارچی از روش تک اسپور استفاده گردید. بدینصورت که توسط آنس سوزنی ظریف میزان کمی از اسپور قارچی به لوله محتوی آب مقطر استریل منتقل شد و سپس توسط لام توما رقت آن محاسبه گردید . پس از تهیه رقتی مناسب، قطرهای از سوسپانسیون حاصل به محیط کشت واتر آگار2درصد انتقال یافت و باگذشت 12 الی 24 ساعت، از کلنی رشد یافته قارچ بر روی محیط کشت - PDA - که از قبل ریخته و سرد شده بود در 3 نقطه انتقال داده شد و به مدت 5 تا 7 روز در دمای25 درجه سانتیگراد انکوباتور نگهداری شدند[8]
ب- شناسایی قارچها:
جهت شناسایی قارچها از محیط کشتهای مختلفی استفاده شد،ازجمله این محیط کشتها سیبزمینی، دکستروز،آگار - PDA - است که یک محیط کشت عمومی شناختهشده است و برای کشت و جداسازی اولیه جدایههای مورداستفاده قرار گرفت، همچنین برای شناسایی جدایهها از محیط کشتهای اختصاصی نظیر - CY20S - Czapek Yeast Extract Agar with20 soucrose CYA - Czapek Yeast Extract Agar - , MEA - Malt Extract Agar - تهیهشده از کمپانی - Merk - آلمان استفاده شد.
در این پژوهش جهت شناسایی جدایههای بهدستآمده با توجه به ویژگیهای مورفولوژیکی کلنیهای قارچی خالصسازی شده، ابتدا تشخیص اولیه احتمالی بر روی آنها صورت گرفت. سپس با استفاده از روش میکروسکوپی جزئیات ریزبینی آنها تحت مطالعه قرار گرفت. بدینصورت که ابتدا به روش اسلاید کالچر با استفاده از محلول لاکتو فنل - اسیدلاکتیک: گلیسیرین: آب مقطر: فنول به نسبت - 20 :40 :20 :20 کاتن بلو از میسیلیوم قارچهای ایزوله شده لام تهیه گردید و سپس با استفاده از میکروسکوپ نوری مشخصات آنها ثبت گردید و با توجه به اختصاصات مورفولوژیکی ریزبینی بهویژه دستگاه زایشی، مورد شناسایی قرار گرفت.
صفات ماکروسکوپی و صفات میکروسکوپی جدایههای حاصل با استفاده از کلید شناسایی.[11] موردبررسی قرار گرفت. بدین ترتیب که ویژگیهای ماکروسکوپی شامل میزان رشد و قطر کلنی - میانگین قطر کلنی3 در هر ظرف کشت - و رنگ کلنی از دو سطح زیرین و زبرین یادداشت شد، برای بررسی ویژگیهای میکروسکوپی ابتدا قارچها را به مدت 3 روز روی محیط کشت آب آگار - Water Agar - قرار داده سپس از آن لام تهیه گردید و با استفاده از عدسی چشمی مدرج و میکروسکوپ با بزرگنمایی 400 و 1000 شکل، اندازه و تزئینات کنیدیها - بهطور میانگین 15 کنیدی - ، طول و عرض پایه - بهطور میانگین 10 پایه - ، اندازه وزیکول - بهطور میانگین10وزیکول - و دو ردیفی و یا یک ردیفی بودن آنها، طول عرض فیالید - Phialide - و متولا - Metulae - بهطور میانگین 10 عدد از هرکدام موردبررسی قرار گرفت.
پ-تعیین توکسین زایی با استفاده از محیط نارگیل آگار: برای این منظور از محیط کشت نارگیل-آگار استفاده شد. برای تهیه محیط کشت، روش Davis و همکاران - 1987 - بهطور جزئی اصلاح شد. بدینصورت که ابتدا مقدار100 گرم پودر نارگیل در 200 میلیلیتر آب جوش ریخته شد، پس از 5 دقیقه و به هم زدن در چند نوبت و زمانی که عصاره نارگیلکاملاً خارج شد، مایع حاصل از 4 لایه پارچه ململ عبور داده شد و 20 گرم پودر آگار به آن اضافه گردید و به مدت 15 دقیقه در فشار 1,5 اتمسفر و دمای 121 درجه سانتیگراد در اتوکلاو سترون و به تشتکهای پتری 8 سانتیمتری منتقل گردید و در زیر نور UV با طولموج 245 تا 366 نانومتر مورد ارزیابی قرار گرفتند
ت-آمادهسازی بستره ذرت
مقدار 100 گرم ذرت بهطور جداگانه در ارلن مایر جداگانه ریخته شد و به نسبت 100 به 27 به هرکدام از بسترهها آب مقطر استریل اضافه گردید. این بسترهها در شرایط دمایی 121 درجه سانتیگراد و فشار 1/5 اتمسفر به مدت 15 دقیقه در دستگاه اتوکلاو ضدعفونی گردید و 24 ساعت بعدمجدداً اتوکلاو گردیدند تا کلیه عوامل خارجی آن از بین برود.
ث -تلقیح قارچ به بسترههای کشت
بعد از خالصسازی قارچ، این قارچ بر روی محیط کشت PDA گسترش داده شد و سپس سوسپانسیون اسپوری به غلظت 1 106 × در آب مقطر تشکیل داده شد و مقدار 10 سیسی از این سوسپانسیون در شرایطکاملاً استریل در زیر هود لومینار به بسترهها اضافه گردید و ارلنهای حاوی تیمارهای اعمالشده در دمای معمولی اتاق و در شرایط 24 ساعت نور و تاریکی قرار گرفتند.
